酶的分离和提纯等

关于酶的分离和提纯等上两次课的内容

第一节酶是生物催化剂第二节酶的结构与功能第三节酶的作用机制第四节酶促反应动力学本次课的内容第五节酶的分离、提纯和活性测定第六节重要的酶类第七节酶在医学上的应用第五章酶第2页,共34页，2024年2月25日，星期天第五节酶的分离、提纯和活性测定Section5theseparation,purificationandmeasurationofactivityofenzyme第3页,共34页，2024年2月25日，星期天

一、酶的分离提纯

目的：研究酶的理化性质。包括结构与功能、生物学作用。作为生化试剂及用作药物的酶要求纯度高第4页,共34页，2024年2月25日，星期天根据酶在体内作用部位胞外酶---易分离胞内酶---须破碎cell分离提纯的原则选择酶含量丰富的材料目前多采用微生物发酵的方法来获取大量的酶制剂避免蛋白质变性：避免强酸、强碱，低温每一步骤，都要测定酶的总活力和比活力第5页,共34页，2024年2月25日，星期天a.选材动物、植物、微生物：含酶量高，易分离的酶分离提纯的步骤选材-破碎细胞-抽提-纯化-保存第6页,共34页，2024年2月25日，星期天b．破碎细胞

动物细菌植物

研磨超声波纤维素酶

匀浆溶菌酶

捣碎机化学溶剂(甲苯)

提取液c．抽提抽提条件的选取应根据酶的溶解度和稳定性等。

（用稀盐、稀酸、稀碱溶液抽提）盐：一般用等渗盐溶液，如0.05mol/L的PBS，

0.15mol/L的NaCl等；T：一般在0～4℃；pH在其稳定范围内且远离其等电点。第7页,共34页，2024年2月25日，星期天

操作要求：

A.尽量减少酶活性的损失

B.低温0～

5℃摄氏度

有机溶剂：-15～-20℃摄氏度

C.抽提液加入EDTA（络合金属）

D.抽提液加入巯基乙醇（防止-SH氧化失活）

E.不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性

F.测定酶的比活力第8页,共34页，2024年2月25日，星期天d.纯化

小分子能自然去除,大分子中核酸用鱼精蛋白或MnCl2沉淀去除,粘多糖用醋酸铅去除。而主要工作则是去除杂蛋白。纯化方法与蛋白质基本相同,此外常用选择性变性法如选择性热变性法(某些酶耐热).第9页,共34页，2024年2月25日，星期天纯化方法选择性变性法盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀方法吸附分离方法几种方法配合使用第10页,共34页，2024年2月25日，星期天

提纯的目的:含量+纯度工艺的选择应权衡含量与纯度,根据酶的应用目的和经济效益取得一个平衡点.每一步都要测定酶的纯度(比活力)并计算纯化倍数和产率以决定该步骤的效益和取舍.酶的比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产率=(每次总活力/第一次总活力)×100%第11页,共34页，2024年2月25日，星期天e．保存

将酶制品浓缩，结晶，以便保存（-20℃）

注意：酶易失活，不可烘干。

可用的方法：

（1）保存浓缩的酶液：（2）浓缩液加入等体积甘油-20℃长期保存第12页,共34页，2024年2月25日，星期天二、酶的活力测定(定量)

酶的活力:又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，酶的活力大小可用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示,即可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的生成量来表示.

一般采用高底物浓度[S]≥100Km(零级反应)测定初速度来定量酶浓度.第13页,共34页，2024年2月25日，星期天

酶活力单位:最适条件下,单位时间内,酶催化底物的减少量或产物的生成量.1个U（1U）:特定条件下,1分钟内生成1微摩尔产物的酶量(或转化1微摩尔底物的酶量).Kat:最适条件下,每秒钟可使1摩尔底物转化的酶量.即1Kat=6×107IU

习惯单位表示酶活力第14页,共34页，2024年2月25日，星期天酶的转换数（turnovernumber）单位时间，每个催化中心所转换的底物分子数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数，在数值上，Kcat＝K3第15页,共34页，2024年2月25日，星期天第六节重要的酶类一、寡聚酶(oligomericenzyme)含有2个以上的亚基，分子量大（35000以上）。可分为含相同亚基的寡聚酶和含不同亚基的寡聚酶。寡聚酶普遍存在，单体酶的数量则较少。（含不同亚基的）寡聚酶的不同亚基执行不同的功能。催化功能和底物载体的功能。寡聚酶是代谢调节的方式之一。第16页,共34页，2024年2月25日，星期天二、同工酶(isoenzyme)

概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞（位置），具有不同分子形式（结构）、理化性质和免疫学性质，但却能催化相同的化学反应（功能）的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）。乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。第17页,共34页，2024年2月25日，星期天乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽亚基mRNA四聚体结构基因a

b乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+–H4MH3M2H2M3HM4点样线第18页,共34页，2024年2月25日，星期天不同组织中LDH同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌肾肝骨骼肌血清-+原点第19页,共34页，2024年2月25日，星期天同工酶在各学科中的应用医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。

适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要第20页,共34页，2024年2月25日，星期天

心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱2345第21页,共34页，2024年2月25日，星期天

关于同工酶的叙述，哪一个是正确的

A.是能催化同一反应，但分子组成，理化性质以及免疫学特征都不相同的一组酶

B.由同一基因编码，生成相同的mRNA，然后把翻译的蛋白质经加工而形成的不同分子形式的酶

C.催化同一反应，理化性质相同，只是分布不同的酶

D.催化同一反应，分子组成不同，理化性质相同，免疫学特征不相同的一组酶

E.催化同一反应，分子组成和理化性质不同，但免疫学特征相同的一组酶第22页,共34页，2024年2月25日，星期天三、诱导酶（inducedenzyme）含量在诱导物存在下显著增高。诱导物是该酶的底物类似物或底物本身。半乳糖苷酶（无葡萄糖时利用乳糖）因为长期服用某种药物而产生抗药性第23页,共34页，2024年2月25日，星期天四、调节酶

一般催化代谢反应链中的单向反应或速度最慢的步骤,因而可调节、控制反应链的总的方向和总速度.

调节酶一般位于代谢反应链的开端或分枝点上。第24页,共34页，2024年2月25日，星期天（一）共价调节酶调节剂通过共价键与酶分子结合,以增减酶分子上的基团来改变酶的活性(高/低,有/无).

常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化－SH与－S－S互变第25页,共34页，2024年2月25日，星期天

酶的磷酸化与脱磷酸化-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白第26页,共34页，2024年2月25日，星期天（二）变构酶(别构酶,属寡聚酶)

（结构）除活性中心外,还有别构中心(结合调节物或称效应剂)

别构效应:调节物与别构中心结合引起酶蛋白构象变化,使酶活性中心对底物的结合和催化作用受影响(改变酶活性),从而改变酶促反应速度.

别构激活/别构抑制别构效应剂:

别构激活剂:通常为底物或底物类似物别构抑制剂:通常为产物第27页,共34页，2024年2月25日，星期天同种效应：一分子的配体结合在蛋白质一个部位影响另一分子同样配体在另一部位的结合。异种效应是一分子的配体在一个部位的结合会影响另一分子的不同配体在另一部位的结合。第28页,共34页，2024年2月25日，星期天*协同效应(cooperativity)

一个寡聚蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应

(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)第29页,共34页，2024年2月25日，星期天变构酶的初速度—底物浓度的关系不符合典型的米氏公式。对于变构酶来说，酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。当底物浓度发生较小变化时，变构酶可以极大程度地控制着反应速度。变构酶可以灵敏地调节酶反应速度。第30页,共34页，2024年2月25日，星期天（一）血清酶测定应用于肝胆疾病的诊断转氨酶血清谷草转氨酶(SGOT)卵磷脂-胆固醇转酰基酶(LCAT)Υ-谷氨酰转肽酶(Υ-GT)（二）血清酶测定应用于急性心肌梗死的诊断肌酸激酶(CK-MB高6倍)乳酸脱氢酶LDH-H1/H2高（三）血清酶测定应用于诊断肿瘤Υ-GTGal-T第七节酶在医药学上的应用一、酶在疾病诊断上的应用第31页,共34页，2024年2月25日，星期天1.助消化酶2.消炎酶3.防治冠心病用酶4.止血酶和抗血栓酶5.抗肿瘤酶类6.其他酶类药物二、酶在治疗上的应用第32页,共34页，2024年2月2