高效液相色谱分析方法的建立

关于高效液相色谱分析方法的建立反相高效液相色谱（RP-HPLC）

分析方法的建立第2页,共79页，2024年2月25日，星期天什么是色谱？色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方法（工具、手段）。除色谱之外，经典（常见）的分离方法：蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等色谱是一种高效能的分离方法色谱分析以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析方法。第3页,共79页，2024年2月25日，星期天什么是高效液相色谱法？HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法的高效能分析方法：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度、高选择性的检测器……广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平，并高速发展。第4页,共79页，2024年2月25日，星期天HPLC的基本配置及流程溶剂

色谱泵手动/自动进样器

HPLC色谱柱检测器废液数据处理系统

第5页,共79页，2024年2月25日，星期天第6页,共79页，2024年2月25日，星期天HPLC的仪器配置泵系统自动进样器色谱柱及柱温箱检测器数据处理系统溶剂第7页,共79页，2024年2月25日，星期天第8页,共79页，2024年2月25日，星期天第9页,共79页，2024年2月25日，星期天第10页,共79页，2024年2月25日，星期天第11页,共79页，2024年2月25日，星期天色谱的发明人­——茨维特（M.S.Tswett）

俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法。1906年正式命名色谱法；Chromatography30年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于70年代第12页,共79页，2024年2月25日，星期天色谱的发明人俄国科学家

M.S.Tswett第13页,共79页，2024年2月25日，星期天正式命名“色谱”的文献中的一段话第14页,共79页，2024年2月25日，星期天一般情况下HPLC不是分析方法的首选

分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）：

滴定分析（原料药、制剂定量分析）紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析）薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析）

HPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的检查；复杂样品定量分析等）什么情况下使用HPLC？第15页,共79页，2024年2月25日，星期天什么情况下使用HPLC？1、对分析结果、测定速度和效率的要求准确度要求：准确定量（RSD<5％）测定速度和效率：快速，单一或多组分测定。2、样品情况样品的复杂情况：HPLC适用于复杂样品的分析，如中药分析、环境分析、体内药物分析、临床药物分析等。第16页,共79页，2024年2月25日，星期天HPLC方法建立的前期工作

样品情况的了解：样品的种类（来源）：植物（中草药）、合成中间体、生物样品（血液、尿液、组织匀浆等）……

样品的种类决定了样品的复杂程度（基质影响），从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方法的确立设计一个大致的方向。待测成分的性质：极性、水溶性、脂溶性、酸碱性等对方法的建立，有重要的指导意义。第17页,共79页，2024年2月25日，星期天待测成分的结构特征：对色谱柱的选择具有一定的指导意义（不是很明显）；对检测器的选择具有指导意义，如：含有生色团（助色团），紫外有吸收，特别是芳香族化合物，可考虑使用紫外检测器待测成分的含量：

决定对柱效的要求（柱效高，可有较低的检测限）决定对检测器灵敏度的要求样品情况的了解：第18页,共79页，2024年2月25日，星期天测定成分的数量以及性质相似程度：单一成分的测定，最简单，随着测定成分的增加，分析的难度增加；组分性质的相似程度越高，分析的难度越高。样品情况的了解：问题：组分性质的相差越大，分析的难度越低，是否越有利于多组分分析？第19页,共79页，2024年2月25日，星期天查阅有关的文献资料文献资料——有：在文献的基础上，调整、改善。不排除在文献基础上全面创新。第20页,共79页，2024年2月25日，星期天文献查阅时应注意的基本内容液相色谱实验所需的基本参数样品预处理方案对照品（标准品）的配制方法流动相：种类及配比，等度或梯度？固定相：色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器及相应参数：如紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱分析条件。第21页,共79页，2024年2月25日，星期天查阅有关的文献资料文献资料——无：结合样品的情况，首先应作一些试探性的工作。（见后面）第22页,共79页，2024年2月25日，星期天评价高效液相色谱方法的标准问题：什么样的分离结果是好的？答：用尽可能少的时间和消耗（人力、物力、财力等）满足分析的要求（准确度、灵敏度、分析速度等）。只有更好，没有最好！第23页,共79页，2024年2月25日，星期天

理论塔板数n

：分离效率（柱效）的量度理论塔板数计算公式：评价液相色谱方法的标准理论塔板数n

：描述组分被保留的程度以及色谱峰谱带展宽的程度。塔板数越大，柱效越高。第24页,共79页，2024年2月25日，星期天W=.5W=2tR=5tR与W是一对矛盾，tR/W可以很好地表达这对矛盾的情况。第25页,共79页，2024年2月25日，星期天

影响柱效的因素很多，可以从色谱理论进行分析，如塔板理论、速率理论等，具体内容参见有关教科书或专著。第26页,共79页，2024年2月25日，星期天什么是色谱的分离度分离度的公式：R：分离程度的量度简称分离度评价液相色谱方法的标准tR1tR2第27页,共79页，2024年2月25日，星期天影响分离度的因素：k、α及n分离度方程：

k

是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱

α是分离因子，描述两个被分离组份容量因子的相对大小。α

＝k2/k1

n是理论塔板数，描述组分被保留的程度以及色谱峰谱带展宽的程度第28页,共79页，2024年2月25日，星期天分离度是色谱分离中主要考虑的因素除分离度之外，在设计色谱方法时，以下几个因素也都要考虑：灵敏度载样量分析速度溶剂损耗成本容易使用（简单）色谱柱寿命第29页,共79页，2024年2月25日，星期天文献资料查询——无根据评价液相色谱方法的标准，结合样品的情况，作一些试探性的工作根据评价液相色谱方法的标准，

进行试探性工作第30页,共79页，2024年2月25日，星期天色谱分析样品预处理的主要目的将待测物质有效地从样品基质中释放出来，制成便于分析测定的稳定液体试样。如：中草药或中成药有效（指标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定等。除去杂质，纯化样品，防止色谱柱的堵塞。如生物样品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。富集浓缩样品或进行衍生化，以达到色谱分析的检测限。一、根据了解的样品信息以及分析目的，建立样品预处理方案第31页,共79页，2024年2月25日，星期天进行样品预处理的必要性

样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力，但样品如果过于复杂（如中药饮片、中成药、生物样品分析等），若不进行必要的预处理，则会影响到分析的准确性，并且可能导致测定失败。任何先进的色谱技术都须有先进的样品处理技术相匹配，样品处理技术的适当与否，直接关系到色谱分析的成本、速度和实用性。第32页,共79页，2024年2月25日，星期天样品预处理的种类物理的分离与浓缩技术

过滤、沉淀分离、吸附、蒸馏、溶剂的挥发溶剂萃取回流、索氏提取、超声波提取固相萃取（SPE）

吸附剂（硅胶、氧化铝）、高分子大孔树脂（苯乙烯－二乙烯苯）、离子交换树脂、键合硅胶等超临界流体萃取化学衍生化技术第33页,共79页，2024年2月25日，星期天HPLC检测器应提供的功能对样品有响应，并有一个输出信号检测器响应值与样品浓度之间在一定的浓度范围内呈线性关系二、选择检测器、确定使用条件第34页,共79页，2024年2月25日，星期天HPLC检测器可以分为：溶质性质检测器（Solutepropertydetectors）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反映流动相的变化（选择型）整体性质检测器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）

没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！第35页,共79页，2024年2月25日，星期天不同种类的检测器的分类整体性质示差折光检测器蒸发光散射检测器电导检测器溶质性质荧光检测器固定波长可变波长光电二极管矩阵电化学检测器放射化学检测器氮/硫检测器质谱检测器紫外/可见光检测器第36页,共79页，2024年2月25日，星期天理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略基线噪音（信噪比高）宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对流动相的压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性（可降低分析组分色谱分离的压力）第37页,共79页，2024年2月25日，星期天检测器的灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10高的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更准确的定量更好地完成色谱峰纯度的确认 （较低的阈值）6:1NS第38页,共79页，2024年2月25日，星期天常用液相色谱的检测器常规检测器示差折光检测器（RefractiveIndex）紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis）荧光检测器（Fluorescence）蒸发光散射检测器（EvaporativeLightScattering）其他检测器（OtherDetectors）高端检测器光电二极管矩阵检测器（PhotodiodeArrayPDA）质谱检测器（MassSpectrometry）第39页,共79页，2024年2月25日，星期天选择液相色谱的检测器要考虑的因素：

你要分离的化合物/样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响溶剂、缓冲盐、改性剂等梯度还是等度（梯度不适于整体性质检测器）准确度要求灵敏度需求是否有双检测的需求第40页,共79页，2024年2月25日，星期天HPLC检测器的选择：通用检测器 RIELSD MS灵敏度 mg ng pg 线性范围 104

否 103流速敏感 是 否 是温度敏感 是 是 是破坏性 否 是 是选择性检测器UV/Vis

FL EC MS灵敏度 ng pg fg pg线性范围 105 103 106 103流速敏感 否 否 是 是温度敏感 否 否 是 是破坏性 否 否 是 是第41页,共79页，2024年2月25日，星期天UV/Vis检测器目前实验室中最流行的选择约75%的HPLC检测器配备的是UV/Vis（其中50%是可变波长，25%是PDA）吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大第42页,共79页，2024年2月25日，星期天UV/Vis的优点简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm对羟基苯甲酸酯类色谱图第43页,共79页，2024年2月25日，星期天UV/Vis的缺点由于不是所有化合物都有紫外可见吸收，因此不是通用检测器（有时也是优点）对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长受流动相组成的影响：用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂（抑制拖尾）也会有影响第44页,共79页，2024年2月25日，星期天背景吸收的影响背景吸收降低了线性范围多数流动相有背景紫外吸收实际浓度理想10吸光度210背景吸收第45页,共79页，2024年2月25日，星期天荧光（Fluorescence）检测器发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光。基态激发态S1S0激发（1）振动能（2）发射（3）1.分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态。2.电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。3.电子失去能量达到基态时发出荧光共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象第46页,共79页，2024年2月25日，星期天荧光检测器原理第47页,共79页，2024年2月25日，星期天荧光检测器的应用环境中的污染物多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、饮料食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素染料维生素及衍生氨基酸生物技术及制药黄曲霉毒素多环芳烃（PAH）维生素第48页,共79页，2024年2月25日，星期天荧光检测器的优点选择性提高灵敏度提高（在pg/fg范围）低背景技术mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDA及MDMA柱上200pgExcitation

=280Emission=360第49页,共79页，2024年2月25日，星期天荧光检测器的缺点不是所有化合物都有荧光，需要衍生；检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏感；Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂的极性和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响；多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果。第50页,共79页，2024年2月25日，星期天溶剂中溶解的气体对响应值的影响实例MinutesColumn-PAHColumn@27ºCEluentA:WaterEluentB:AcetonitrileGradient:60%Bto100%Busingcurve9in12minutesHold11minutesBacktoinitialconditionsFlowRate1.2ml/minInjection:20ulTimeprogrammedwavelengthchanges20.521.022.01000MV充分脱气未充分脱气FluorescenceDetector1231.Benzo(b)flouranthene-400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb第51页,共79页，2024年2月25日，星期天蒸发光散射（EvaporativeLightScattering）检测器用氮气把流动相吹成细雾状液滴；流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉；蒸发的溶剂被除去；溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束并与入射光相交，产生散射；散射光在光电倍增管（PMT）上产生信号；PMT的输出与溶质的量呈比

例关系第52页,共79页，2024年2月25日，星期天蒸发光散射检测器原理示意图EvaporativeLightScattering简称：ELSD入射光样品颗粒散射光光电倍增管第53页,共79页，2024年2月25日，星期天ELSD－优点及应用领域通用型检测器：一般情况下，比流动相挥发性小的且能产生颗粒的物质都能被检测可以作梯度洗脱；检测下限可到纳克级水平对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相应用领域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制药行业表面活性剂天然产物第54页,共79页，2024年2月25日，星期天ELSD－缺点不能使用含不挥发性成分的流动相（例如：磷酸盐）；要求使用雾化气源（一般是氮气，也可使用压缩空气）；当色谱条件改变时，雾化及除溶剂的参数需要重新优化；破坏性技术；蒸发出的溶剂要排到室外；对挥发性化合物的检测不理想，（不出峰）；一般得到的是非线性校正曲线；某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器第55页,共79页，2024年2月25日，星期天光电二极管矩阵（PhotoDiodeArray）检测器PhotoDiodeArray简称：PDA或DAD(DiodeArraydetector)入射光流通池光栅光电二极管矩阵第56页,共79页，2024年2月25日，星期天PDA检测器－特点三维水平的吸光度检测器二极管矩阵检测器是在1982年首度出现的需要相应的软件进行数据的分析第57页,共79页，2024年2月25日，星期天PDA检测器的用途及要求光电二极管检测器可以提供许多有用的功能光谱信息色谱峰纯度谱库拟合像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要：高的信噪比；好的线性另外；还需要：光学分辨率光谱灵敏度及光谱分析软件第58页,共79页，2024年2月25日，星期天PDA的优点及缺点优点好的选择性、线性提供色谱峰的UV/Vis光谱图（峰确认）可提供纯度估计（有限度的）缺点灵敏度略低于V/Vis检测器第59页,共79页，2024年2月25日，星期天质谱（MassSpectrometryMS）检测器m/z+/-MS： 是一种按照分子量及其电荷分离物质的技术，经过多年的不断开发及改进，已经使质谱成为一种多功能、高灵敏度，并被越来越广泛使用的分析技术。LC/MS：液相色谱与质谱的连用。需要： 除去HPLC的溶剂；产生离子；分离离子；检测离子；计算离子强度；处理数据。第60页,共79页，2024年2月25日，星期天色谱分离中的四种情况如图所示：④完全分离，柱效高，选择性（

）好。①分离效果差，柱效低，选择性（

）低；②完全分离，柱效高，峰窄，选择性（

）低；③完全分离，选择性（

）增加，柱效低，峰宽；三、

色谱分离度及其分离条件的选择1

色谱分离方程式第61页,共79页，2024年2月25日，星期天

假设两组分的塔板数相等，k平均=(k1+k2)/2。因此可导出R与n、和

k

的关系：分离方程式同时反映了色谱柱效能n和选择性α（ri,s相对保留值）以及容量因子k对分离度的影响，是一个综合指标。n为理论塔板数；k2为色谱图上相邻两组分中第二组分的容量因子；k平均可用k2代替；α为分配系数比，α＝K2/K1=k2/k1。分离方程式第62页,共79页，2024年2月25日，星期天（有关色谱方程式的讨论）(1)分离度R与柱效的关系分离度R与理论塔板数n有关。由色谱分离方程式可得：

因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。2提高分离度的方法第63页,共79页，2024年2月25日，星期天(2)分离度R与分配系数比

的关系

越大，柱选择性越好，对分离有利。

的微小变化可引起R较大改变。如，当

从1.01增加至1.10(增加9%)时，R则增加9倍(但>1.5,R增加不大)

。改变

的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。(3)分离度R与容量因子k的关系

k增加，分离度R增加，但分析时间也将增加。当k>10，则R的增加不明显。通常k控制在1~10之间。最好1~5。改变k的方法有：适当增加柱温、改变流动相性质以及固定液膜厚度。第64页,共79页，2024年2月25日，星期天容量因子（k）、柱效（H）及分配系数比（α）对分离度（R）的影响HH第65页,共79页，2024年2月25日，星期天3

分离条件选择的基本依据在分离多组分复杂混合物时，分子量相近、沸点差小及极性相似的组分，保留值相差小，分离较难。有必要设立一个指标，表征这种难分离的物质对。根据热力学参数对分离的影响，设立Sd值作为难分离物质对的量度。在一定的色谱条件下，规定：k1、k2为容量因子，β*为动力学系数(1)难分离物质对的预测k2/k1比值越小，β*越大，Sd值就越小，分离越难。k2/k1属于热力学参数，β*属于动力学参数。如温度如流速第66页,共79页，2024年2月25日，星期天(2)分离度的确定分离度的确定，应根据样品的复杂程度、分离的难易程度、误差要求等作出选择。对一个分离来说，并不是分离度越高越好，换句话：够用、且误差符合要求即可。分离度较低，但可用逢高定量，误差符合要求。分离度适中，有误差，但是误差<5%。第67页,共79页，2024年2月25日，星期天(3)流动相线速度的选择根据Vandeemter方程式有一个最佳流速，也就是H值最小时的流动相流速。但是由于这个流速一般较小，考虑到分析效率，有时会牺牲柱效而提高流速。(4)色谱柱温度的选择（主要适用于气相色谱）在保证最难分离的物质对达到预期的分离前提下，柱温越高越好，可以缩短组分流出色谱柱的时间，提高工作效率，但是应特别注意仪器和固定相所能承受的温度最高限度。(5)进样量选择考虑到色谱柱的容量、组分在流动相中的溶解度以及检测器的灵敏度及线性范围，所以，在保证达到检测器灵敏度的前提条件下，采用尽可能小的进样量。(6)其他分离的选择如柱长、流动相种类和组成、固定相、梯度洗脱、程序升温等等，参见后续课具体章节。第68页,共79页，2024年2月25日，星期天色谱柱种类的选择首选C18柱，可解决约80％的分离问题。其次C8、C2等。色谱柱规格的选择常用150mm×4.6mm、250mm×4.6mm、柱长小于100mm、柱内径小于4.6mm的色谱柱常用于MS检测器（流动相流速<1.0mm）。四、选择HPLC方法；尝试性分离；建立分离条件第69页,共79页，2024年2月25日，星期天流动相种类的选择反相HPLC常用的流动相种类一般为甲醇、乙腈、四氢呋喃、水或一定浓度的酸性水溶液（pH1~7，甲酸、乙酸、磷酸、磷酸盐、柠檬酸、TFA等）。流动相配比的选择

初步实验：甲醇－水或乙腈—水(80:20)或(90:10)

根据峰形及分离情况，逐步调整配比，必要时改变溶剂的种类和溶剂的“元”数，并适当改变流动相的酸度以及加入适当的“防拖剂”、“改性剂”等。洗脱方式的选择等度洗脱？？在满足分离要求的情况下，首选。梯度洗脱？？第70页,共79页，2024年2月25日，星期天梯度洗脱描述方式：以甲醇－水二元梯度洗脱为例：

1、文字法（文献表达方法）：

0-6.5min（30：70），8.5-13min（50：50）

2、表格法：（也可用于正式论文中）第71页,共79页，2024年2月25日，星期天3、图示法以时间作为横坐标，以某一元的溶剂比例作为纵坐标作图。甲醇min305006.58.513.0甲醇－水:0-6.5min（30:70），8.5-13min（50:50）甲醇－乙腈－水:0-6.5min（20:10:70），8.5-13min