【灵芝孢子粉中黄曲霉毒素的检测3500字（论文）】

灵芝孢子粉中黄曲霉毒素的检测目录TOC\o"1-3"\h\u摘要 11.前言 12.任务来源 23.基本概念与原理 24.方案设计 34.3.1样品的前处理 44.3.2校准曲线的绘制 45.色谱分析检测结果 45.1样品色谱图 45.2样品加标色谱图 45.3线性回归方程及检出限 56.方案设计成果 57.方案设计总结 6参考文献 7摘要建立免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定灵芝孢子粉中的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。该方法样品用甲醇-水提取，稀释后经免疫亲和柱净化，用高效液相色谱法检测，外标法定量【1】。以C18柱为分离色谱柱，甲醇-水(45-55，体积/体积)溶液为流动相洗脱，流速0.8mL/min，柱温30℃，进样量10μL，荧光检测器检测，激发波长360nm，发射波长440nm。4种毒素在标准溶液为0.28、0.56、1.12和2.24、4.48ng/ml的条件下呈良好的线性关系，G2、G1、B2和B1相关系数分别为0.9992、0.9996、0.9996和0.9998。检测灵敏度分别为0.3、0.3、0.2和0.2ug/kg。该方法灵敏度高，适用于灵芝孢子粉中的黄曲霉毒素总量的测定。关键词：黄曲霉毒素；免疫亲和柱；高效液相色谱；灵芝孢子粉1前言吉林出入境检验检疫局由原吉林进出口商品检验局、长春动植物检疫局和长春卫生检疫局合并组建，于1999年11月正式挂牌成立。是主管吉林省出入境卫生检疫和进出境动植物检疫，以及进出口商品检验、鉴定、认证和监督管理的行政执法机构，直属国家质量监督检验检疫局总领导。吉林出入境检验检疫局专业技术力量雄厚。拥有气相色谱仪、液相色谱仪、原子吸收光谱仪、质谱仪、紫外光分光光度计、快速免疫检测分析仪、电子拉力实验机等国内、国际先进的精密仪器设备。有2个国家级重点实验室，即“玉米及其深加工产品检测重点实验室”和“参茸与参茸制品检测重点实验室”。并建立了化学分析实验室、生物检测实验室、物理性能实验室、机电检验实验室、艾滋病初筛实验室等。吉林出入境检验检疫局重视科技的发展，人才技术过硬，实验室设备完善，使吉林出入境检验检疫局在'农残'等检测方面做出了突出贡献，在国内取得了较高的声誉。黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，二氢呋喃香豆素的衍生物，主要由黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物。已分离鉴定出12种包括B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，Q，HI，GM，B2a和毒醇，基本结构为二呋喃环和香豆素。目前，分离鉴定黄曲霉毒素12种中B1、B2、G1和G2为主要产物。其中，黄曲霉毒素B1是毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素进入体内后，主要在肝细胞内质网微粒体混合功能氧化酶系的作用下进行代谢。黄曲霉毒素是目前已知最强致癌物之一，被世界卫生组织划定为一类致癌物。其致癌特点：致癌范围广，致癌强度大，可诱发多种癌，还可诱发畸胎。所以检测食品、粮食、保健品中的黄曲霉毒素尤为重要。但直至目前仍无针对灵芝孢子粉中黄曲霉毒素的测定方法，因此需要建立地方标准对灵芝孢子粉中的黄曲霉毒素进行检测。 2任务来源吉林省是中国灵芝及灵芝孢子粉的主要产地之一，有不少灵芝种植基地，吉林省长白山地区更是作为灵芝的道地产地而驰名中外。但灵芝孢子粉在生产、运输、存放等过程中，如果环境条件不适合，将会产生黄曲霉毒素等生物毒素，影响人体健康。2014年曾接检客户委托检测灵芝孢子粉中的黄曲霉毒素B1及总量的检测，但直至目前仍无针对灵芝孢子粉中黄曲霉毒素的测定方法，因此只能用单位自行研制的检测方法进行检测。现在需要建立灵芝孢子粉中黄曲霉毒素的检测方法，将对吉林省灵芝孢子粉的出口及销售起到积极的作用。因在此公司实习期间，参与了建立检测灵芝孢子粉中黄曲霉毒素的检测方法的工作，所以把本检测内容作为毕业设计的课题。设计思路：根据检测花生、大米中黄曲霉毒素的方法用甲醇-水提取，提取液经分取和稀释后，经免疫亲和柱净化，样液供高效液相色谱仪（荧光检测器）测定，外标法定量。3基本概念与原理3.1基本概念灵芝孢子粉是灵芝成熟时释放出的孢子（种子），是灵芝的精华部分，有效成分非常丰富，具有改善胰脏血液循环，降血糖，降血脂，改善睡眠质量，辅助肿瘤治疗等功效。但灵芝孢子粉在生产、运输、存放等过程中，如果环境条件不适合，将会产生黄曲霉毒素等生物毒素。灵芝孢子粉含油量较高，破壁后极易感染黄曲霉毒素，影响人体健康。免疫亲和柱净化是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。由于免疫亲和柱的专一性吸附特征，因此具有定量准确、灵敏和可靠等诸多优点。采用黄曲霉毒素免疫亲柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生-荧光检测器测定灵芝孢子粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的含量。该方法具有样品前处理简单、净化效果好,准确度高和重现性好等优势[3]。高效液相色谱的原理：由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同、随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定顺序从固定相中流出。与合适的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。3.2基本原理试样经甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，过免疫亲和柱净化，用带荧光检测器的高效液相色谱仪（经光化学柱后衍生器）测定黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的含量，外标法定量。4方案设计4.1仪器、试剂与样品高效液相色谱仪型号为waterse2695，配Waters2475荧光检测器,Waters柱后衍生装置，电子天平，移液枪；黄曲霉毒素标准品溶液；免疫亲和层析柱，纤维滤纸，具塞离心管，高速冷冻离心机，玻璃试管。甲醇为色谱纯，水为去离子水，氯化钠，70%甲醇-水（7:3，体积/体积），80%甲醇-水（8:2，体积/体积）。光化学柱后衍生器，样品为灵芝孢子粉。4.2高效液相色谱条件流动相：甲醇-水（45+55）梯度流速:0.8ml/min压力：不超过4000色谱柱：C18柱进样量：10.0ul柱温：25℃检测器：PDA荧光检测器波长：360-440nm4.3设计步骤4.3.1样品的前处理（1）提取准确称取灵芝孢子粉1g，加入氯化钠1g，置于具塞离心管中，加入25mL甲醇水（70%甲醇水）后涡旋1min，超声20min，10000r/min离心1min，从上清液中取出10mL放入具塞离心管中，加入20mL水，涡旋混匀后，经纤维滤纸过滤，待净化。（2）净化免疫亲和柱经活化后，准确吸取上述滤液15mL加入免疫亲和柱中，连接流速控制系统，控制流速不得超过1滴/s，上样结束后，用10mL水淋洗，抽干免疫亲和柱。用1mL甲醇洗脱至玻璃试管中，再在玻璃试管中加入1mL水，涡旋混匀后，经0.22um微孔膜过滤，供检测用。（3）检测4.3.2校准曲线的绘制取5个2mL的进样小瓶，加入通过计算后每个浓度所需的黄曲霉毒素标准溶液，然后用甲醇溶液定容，配制5个浓度点分别为0.28、0.56、1.12和2.24、4.48ng/mL。黄曲霉毒素的标准溶液浓度为112ng/mL。 5色谱分析检测结果5.1样品色谱图5.2样品加标色谱图5.3线性回归方程及检出限黄曲霉毒素线性回归方程相关系数R检出限（ug/kg）G2Y=2.40e+005x-8.86e+0020.99920.3G1Y=1.24e+005x+3.58e+0020.99960.3B2Y=4.94e+005x-9.85e+0020.99960.2B1Y=2.42e+005x-1.46e+0030.99980.26方案设计成果表6-1不同甲醇-水浓度的回收率黄曲霉毒素30%甲醇-水回收率50%甲醇-水回收率G20.11131.7%0.20157.4%G10.30128.9%0.59056.7%B20.06622.7%0.14449.6%B10.17815.8%0.50344.9%

表6-2不同甲醇-水浓度的回收率黄曲霉毒素80%甲醇-水回收率70%甲醇-水回收率G20.11934%0.18653%G10.90987.4%0.72370%B20.22176.2%0.21775%B10.89179.5%0.76668.4%根据上述检测数据证明有机相高回收率好,样品处理是用不同浓度的甲醇-水溶液提取,经免疫亲和柱净化,80%和70%甲醇水溶液的提取效率显著高于20%甲醇水、30%甲醇水、50%甲醇水、但70%甲醇水溶液的提取效率较好,但用70%甲醇水提取的回收率较好，最中确定70%甲醇-水溶液提取[2]。黄曲霉毒素易溶于如甲醇等中等极性的溶剂,甲醇洗脱回收率较大，因此样品处理确定采用甲醇进行洗脱。同时对甲醇提取液的用量进行了考察,分别采用甲醇1.0、1.5、2ml对免疫亲和柱进行洗脱并收集各洗脱液进样分析[5]。回收率计算显示,1.0ml甲醇即可实现从免疫亲和柱上将黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1完全洗脱的目标。因此,最终甲醇洗脱体积确定为1.0ml[6]。7方案设计总结检测结果证实,甲醇-水体系能对灵芝孢子粉样品中的黄曲霉毒素进行有效提取,经免疫亲和柱净化和柱后衍生荧光检测器检测，能有效分析灵芝孢子粉样品中4种黄曲霉毒素含量。采用该方法处理样品，不受样品中其他组分干扰,检测方法简便快速、灵敏度高、选择性和稳定性好、回收率较高、重现性好,适合灵芝孢子粉中黄曲霉毒素的定量分析。参考文献[1]熊平文，梁权，王雄，尚沁沁，余东游，果旗.免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素[J]，2015[2]李莹，李建华，何强，付宇，孔祥虹，邹阳，张璐.高效液相色谱-柱后衍生法测定植物油脂中4种黄曲霉毒素[J]，2015，（11）[3]朱鹏飞，刘文卫，凌霞，姚誉阳，孔令灿.光化学衍