GB-T15670-28-2017农药登记毒理学试验方法第28部分：慢性毒性与致癌合并试验

部分代替GB/T15670—1995农药登记毒理学试验方法第28部分：慢性毒性与致癌合并试验Toxicologicaltestmethodsforpesticidesregistration—Part28:Combinedchronictoxicity/carcinogenicitystudy2017-07-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布I——第2部分：急性经口毒性试验——第3部分：急性经口毒性试验——第4部分：急性经口毒性试验序贯法；概率单位法；—第5部分：急性经皮毒性试验；——第10部分：短期重复经口染毒(28天)毒性试验；——第11部分：短期重复经皮染毒(28天)毒性试验；——第12部分：短期重复吸入染毒(28天)毒性试验；——第13部分：亚慢性毒性试验；——第14部分：细菌回复突变试验；——第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；——第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；——第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；——第18部分：啮齿类动物显性致死试验；——第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；——第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；——第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验；——第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；——第23部分：致畸试验；——第24部分：两代繁殖毒性试验；——第25部分：急性迟发性神经毒性试验；——第26部分：慢性毒性试验；——第27部分：致癌试验；——第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；——第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第28部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分与GB/T15670—1995的慢性毒性与致癌合并试验部分相比主要变化如下：——修改和调整了总体结构和编排格式；——增加了一些章节内容(见第1章、第2章、第3章、第5章、6.2.3、6.5.3、第7章和第8章);——修改了对受试物的要求(见6.1,1995年版的19.5.1);——修改了对实验动物的要求(见6.2.2,1995年版的19.3.2)。Ⅱ本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司归口。1农药登记毒理学试验方法第28部分：慢性毒性与致癌合并试验GB/T15670的本部分规定了慢性毒性与致癌合并试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记进行的慢性毒性与致癌合并试验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。慢性毒性chronictoxicity动物在正常生命周期的大部分时间内反复接触受试物所引起的健康损害效应。在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，未能观察到与染毒有关的有害效应的受试物最高剂量或浓度。观察到有害作用最低剂量水平lowestobservedadverseeffectlevel;LOAEL在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，观察到与染毒有关的有害效应的受试物最低剂量或浓度。靶器官targetorgan受试物引起机体出现显著毒性效应的器官。化学物质引起肿瘤发生率和/或类型增加、潜伏期缩短的效应。能使机体产生肿瘤、肿瘤发生率增加或肿瘤潜伏期缩短的化学物质。4试验目的在动物的大部分生命周期内，将受试物反复给予实验动物，同时观察对实验动物的慢性毒性作用和2化学致癌作用，确定慢性毒性的未观察到有害作用剂量水平(NOAEL)、观察到有害作用最低剂量水平(LOAEL)和致癌的可能性。5试验概述实验动物在正常生命周期的大部分时间内反复经口、经皮或经呼吸道给予不6试验方法根据受试物的特性或试验目的，可将受试物混入饲料、饮水给物，应使用同一批生产的受试物。如不能一次提供足够量的受试物，不同批次受试物的如果受试物掺在饲料或饮水中染毒，要将受试物与水或饲料混匀并测定受试物在饲料或饮水中的含量或浓度、稳定性和均一性。浓度应在理论浓度的士15%以内。经皮染毒还应考虑赋形剂对受试物皮肤通透性的影响。慢性毒性与致癌合并试验可选用大鼠、小鼠等，首选大鼠，使用其动物等级应为无特定病原体动物(specificpathogen-freeanimal,SPF)。实验应选用雌、雄两种性别的动物。断乳后的健康动物，啮齿类动物周龄为4周～6周。动物购买后于试验前适应环境5d～7d,适应期应进行检疫观察。开始试验前应对动物的肿瘤自发率有一定了解。大鼠慢性毒性与致癌合并试验期限为104周，每组动物不少于160只，雌雄各半，应在26周、52周和78周各剂量组计划解剖20只(雌雄各半)。小鼠慢性毒性与致癌合并试验进行78周，每组动物不少于140只，雌雄各半，应在26周、52周各剂量组计划解剖20只(雌雄各半)。每组动物体重差异不超过同性别平均体重的士20%。试验结束时各剂量组每种性别的动物能满足统计学要求(啮齿类动物每组每性别动物应不少于10只)。如果低剂量或对照组动物存活率只有25%时，可以结束试验。如两性别死亡有明显差异，其结束的时间可以不同。个别情况下因受试物毒性明显而造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。本试验应在屏障系统内(barriersystem)进行。实验动物的环境设施应符合GB14925对相应等级每一房间只能饲养一种动物，每一房间只供一种受试物试验用(除非有证据表明不同受试物对动物无影响),也应考虑受试物对对照组动物的影响。笼具等物品应便于消毒和清洁，约每2周更换一次。应避免使用消毒剂和农药等，特别是与动物有3密切接触的部位更应注意。如果受试物的毒性较低，则加入饲料的受试物比例较大，应注意混入饲料中的受试物不应超过5%,否则会对动物正常营养产生影响。饮水应不含对试验有影响的污染物，应该对水质进行监测。饮水系统应定期消毒。至少应设三个剂量组及一个相应的对照组。剂量选择可参考急毒性和代谢研究等资料确定。剂量设计原则为：数的改变，但不能明显缩短动物寿命(肿瘤引起的除外),高剂量组剂量设计不大于1000mg/kg经口、经皮和经呼吸道吸入是三种主要染毒途径。选择何种途径要根据受试物的理化特性和对人有代表性的接触方式。可将受试物混入饲料或饮水，或采用灌胃法染毒。受试物混在饲料或饮水中应每周染毒7d;如采用灌胃法，每周染毒5d或7d,染毒的第1个月每周按体重调整一次染毒量，以后每4周调整一次染毒量，半年以后每13周调整一次。首次染毒开始前24h,将动物躯干背部染毒区的被毛去除，去毛时应小心不可损伤动物皮肤，以免引起皮肤通透性的改变。此后视动物被毛生长情况，大约每周要对染毒部位去毛，各组毛面积应相近。受试物应尽可能薄而均匀地涂敷于整个染毒区域，染毒部位的面积约相当于动物体表面积的10%,应通过对动物体重的测定确定染毒部位的面积，若受试物毒性较大，可相对减小染毒区域的面积。应使用玻璃纸和无刺激的胶带将受试物固定，以保证受试物与皮肤有良好的接触和防止受试每天染毒6h,每周染毒5d或7d。每周对染毒部位去毛一次。染毒的第1个月每周按体重调整一次染毒量，以后每月调整一次染毒量，半年以后每3个月调整一次。间歇暴露方式染毒时间每天6h,每周5d;连续暴露方式为每天22h～24h,留下约1h给动物喂食和清理染毒柜，每周7d。染毒时间从染毒柜达到预定浓度开始计算。柜内空气中受试物浓度要求4染毒柜换气次数应达到12次/h～15次/h;柜内氧含量≥19%;柜内受试物浓度均匀；对照组与染c)柜内温湿度：温度(22±3)℃,湿度30%～70%(水性受试物染毒时除外),应连续监测；d)粒径大小：粒子应是可吸人大小，空气动力学直径MMAD(质量中值空气动力学直径)在1μm～4μm范围。应在动物呼吸带采样检测粒径。在气溶胶发生装置调试时要反复检测，稳定后可定期检测。反应的动物进行连续详细观察。试验期内应每天观察动物的死亡和濒死情况，必要时还应增加观察次数并采取适当的措施尽量减前13周每周记录体重一次，此后每4周记录一次。在前13周每周记录一次摄食量，此后每4周记录一次，如动物健康状况或体重无异常改变可13周记录一次。经饮水染毒时应记录饮水消耗量。应在试验开始前和每次解剖前至少对高剂量组和对照组动物使用检眼镜进行内眼检查，若发现动在染毒开始后每隔约6个月检查一次，试验结束时一次。试验中期大鼠每组每性别可检查10只。试验每隔6个月和试验结束时进行血液生化检查。试验中期大鼠每组每性别可检查10只。测定指标至少应包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TCH)、钾、钠5集其血样进行血液及生化检查。如有必要还可进行其他方面的检查，其结果常可为病理检查提供重要提示。组织病理学检查的原则为：a)高剂量组和对照组大体解剖检查所有固定保留的器官和组织进行组织病理学检查；b)发现高剂量组病变后再对中、低剂量组相应器官和组织进行组织病理学检查；c)应对大体解剖检查肉眼可见的病变器官和组织进行组织病理学检查；d)试验过程中死亡或濒死动物，应对全部保留的组织和器官进行组织病理学检查；e)如果数据显示高剂量组动物的生存期明显缩短，或产生一些影响肿瘤发生的毒作用时，则中剂量组亦应按上述高剂量组一样进行组织病理学检查。7试验结果和评价所有数据应采用适当的统计学方法进行评价，统计学方法应在试验设计时确定。慢性毒性与致癌合并试验应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和解剖及组织病理学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程其他一般或特殊的毒性作用。慢性毒性与致癌合并试验在评价致癌性同时要尽可能地提出统计学上有意义的未观察到有害作用剂量水平(NOAEL)和观察到有害作用最低剂量水平(LOAEL)。肿瘤发生率是整个试验终结时患肿瘤动物数在有效动物总数中所占的百分率，按式(1)计算。有效动物总数指最早发现肿瘤时的存活动物总数。6采用世界卫生组织提出的四条判断致癌试验阳性的标准：b)染毒组与对照组动物均发生肿瘤，但染毒组发生率明显增高；c)染毒组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性肿瘤或只少数动物有多发性肿瘤；d)染毒组与对照组动物肿瘤的发生率无显著性差异，但染毒组中肿瘤发现的时间较早。上述四条中，试验组与对照组之间的数据经统计学处理后任何一条有显著性差异即可认为该受试否定受试物的致癌性。致癌试验阴性结果确立的前提条件如下：a)任何一组因自溶或因管理问题所造成的动物损失都不能高于10%。b)小鼠在15个月，大鼠在18个月时，各组动物存活率不小于50%;小鼠在18