RNA聚合酶沿DNA分子移动-于都中学

§1-2基因工程的基本操作程序南昌市第二中学付晓华

§1-2基因工程的基本操作程序南昌市第二中学付晓华ww1什么叫基因？基因－－有遗传效应的DNA片段。什么叫遗传效应？

遗传效应－－能转录为mRNA，继而翻译为蛋白质；能转录为核糖体RNA；能转录为转运RNA。

什么叫基因？基因－－有遗传效应的DNA片段。什么叫遗传效应？2补充：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚酶结合位点启动子终止子

RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。

补充：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编3①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。

①不能转录为信使RNA，不能：能转录相应的信使RNA，能4补充：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：

补充：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚酶内5真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子

真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序6原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码不一样.真核细胞基因结构要长一些.

原核细胞真核细胞不同点编码区是编码区是间隔的、_____的都7基因工程的基本操作程序第2节

基因工程的基本操作程序第2节8基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定

基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体9一、目的基因的获取2、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子3、获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成1、目的基因的来源①从自然界已有的物种分离②人工方法合成

目前被广泛提取使用的有：苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。

一、目的基因的获取2、目的基因主要是指___________10(1)从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？

(1)从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？www.jxj11概念：基因文库（genelibrary）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

概念：基因文库基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）12基因组文库:

基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:

基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.

基因组文库:www.jxd13限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库的构建是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。此种构建基因文库的方法称直接分离法（或鸟枪法）。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。思考：基因文库如何构建？

限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库的构14是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。此种构建基因文库的方法称反转录法。2)cDNA文库的构建基因重组反转录酶mRNAcDNA

是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反15基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库构建的比较

基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库构16基因组文库与部分基因文库的关系DUCK179制作

基因组文库与部分基因文库的关系DUCK179制作www.jx17思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性。

思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关18(二)利用PCR技术扩增

(二)利用PCR技术扩增w19(2)利用PCR技术扩增①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________(做启动子)、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增

(2)利用PCR技术扩增①概念：PCR全称为_______20⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链

⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板b、215/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—G引物ⅡPCR原理变性复性延伸

5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ22PCR(多聚酶链式反应)

PCR(多聚酶链式反应) 23化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测（3）人工合成：若基因_____，核苷酸序列又

______，则可用此法。较小已知

化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基24谢谢大家！

谢谢大家！25§1-2基因工程的基本操作程序南昌市第二中学付晓华

§1-2基因工程的基本操作程序南昌市第二中学付晓华ww26基因工程的基本操作程序第2节

基因工程的基本操作程序第2节27①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。②用_____________切断目的基因，使其产生_________________。2、基因表达载体的构建——核心③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同

①用一定的_________切割2、基因表达载体的构建——282、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种

2、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子限制酶处理一个29经此过程，基因表达载体的构建就成功了？思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？

经此过程，基因表达载体的构建就成功了？思考：作为基因工程表达30不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。

不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用31基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞

基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c32①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意

①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DN333、将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达

3、将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入将目的34常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径3、将目的基因导入受体细胞

常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农351、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌

1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子36（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用37（3）花粉管通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

（3）花粉管通道法植物花粉在柱头上萌发后，花382、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射法操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物

2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射法操作程序:提纯含目393、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA

3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠40通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。所以要对受体细胞作怎样的处理？对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测怎样进行检测？

通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测导入过程完成后，全部414、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交Goon

4、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测42知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。

知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是43

44DNA附着在膜上硝化纤维素加探针报告基因（含荧光素分子）变性DNA杂交（如检测SARS病毒等）abcd返回

DNA附着在膜上硝化纤维素加探针报告基因（含荧光素分子）变性45归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：

归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因www.jxjyz46求异思维你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？

反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以5′→3′方向合成DNA。

cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

求异思维你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分47寻根问底

构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。

1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？

寻根问底构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是48

2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。

2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这49思考与探究：1.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

思考与探究：1.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,50有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。2.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基513.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？基本操作如下：

（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。

（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。

（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

3.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时521）以下说法正确的是