蛋白质的不稳定性及其对策

关于蛋白质的不稳定性及其对策蛋白质分子与小分子物质稳定性比较蛋白质小分子大量潜在的反应位点很少反应位点大量离子化位点很少离子化位点缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化有二级、三级、四级高级结构没有高级结构分散（胶体）水相溶液中为单一相和连续相温度效应是间断的（变性）温度效应是连续的易支持微生物生长第2页,共14页，2024年2月25日，星期天蛋白质药品中添加剂的作用1.抗微生物保藏剂2.可溶性增强剂3.冻干产品填充剂4.等渗溶液添加剂第3页,共14页，2024年2月25日，星期天蛋白质中常见的稳定性与相容性问题及解决方法稳定性问题可能的解决方案水解、脱氨（如天冬酰胺）控制PH、缓冲液、低离子强度氧化（如甲硫氨酸氧化）抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加工与包装过程Β-消除反应低PH、螯合剂转肽作用控制PH、低浓度外消旋作用控制PH、缓冲液二硫键交换硫醇的消除（如半胱氨酸）冷冻干燥过程中的变性防冻剂/防失水剂凝集、沉淀控制PH、表面活性剂、减低机械压力表面吸附表面活性剂、白蛋白、预饱和第4页,共14页，2024年2月25日，星期天化学稳定性1.PH、水解和缓冲液2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法3.其它化学不稳定性及制剂方法第5页,共14页，2024年2月25日，星期天1.PH、水解和缓冲液稳定性、可溶性和PH遵循一个规律：高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导致低物理稳定性。例子：胰岛素溶解度与脱氨反应第6页,共14页，2024年2月25日，星期天1.水解和脱氨反应氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺影响因素：极端PH、温度和离子强度最明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨速率高于水解速率改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸）残基处的裂解或环化。第7页,共14页，2024年2月25日，星期天缓冲液 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变影响着蛋白质可溶性和稳定性。注意的问题：1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓冲系统的缓冲能力，离子强度。2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离子强度。3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。第8页,共14页，2024年2月25日，星期天2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法

1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、金属离子及各种自由基激活剂。2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能导致二硫键的形成和生物活性的丧失。3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作用和与重金属发生配位作用。4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。第9页,共14页，2024年2月25日，星期天

蛋白质制剂中的抗氧化剂和螯合剂试剂制剂中的使用浓度/%抗氧化剂（所以水溶液）抗坏血酸（异抗坏血酸、抗坏血酸钠）0.1-1.0亚硫酸盐（亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠）0.1-0.5硫甘油0.1-0.5巯基乙酸0.05-0.2半胱氨酸盐酸盐0.1-0.5螯合剂（所有水溶液）乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐）0.05-0.1柠檬酸/柠檬酸盐0.02-1第10页,共14页，2024年2月25日，星期天制剂中使用抗氧化剂常出现的问题1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS），磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧化3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度依赖性，多数发生在PH6-74.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸氢盐加速胰岛素破坏第11页,共14页，2024年2月25日，星期天防止氧化降解的措施1.低温下制备与储藏2.使用螯合剂消除金属催化反应3.提高离子强度，减少二硫键的形成4.消除过氧化物和金属污染物5.避光6.注意光反应和磷酸盐缓冲液条件下可能形成游离基的反应7.生产过程中用氮或氩代替氧8.当需维持所需蛋白质的可溶性和抗水解稳定性时，尽可能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，使用螯合剂第12页,共14页，2024年2月25日，星期天其它蛋白质化学不稳定性及制剂方法1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下显著加速；氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸对策：降低