ELISA试验的质量保证

ELISA测定技术的

发展和质量控制

1完整版pptELISA测定技术的

发展和质量控

ELISA试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。然而，影响ELISA试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。2完整版pptELISA试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断一、ELISA试剂盒测定技术的发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。3完整版ppt一、ELISA试剂盒测定技术的发展3完整版ppt1、基因工程试剂对免疫测定技术

发展的影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。4完整版ppt1、基因工程试剂对免疫测定技术

HBsAg试剂特点

（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗，多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位。可测得HBsAg变异样品。提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用ParlEhrich学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05nｇ/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml例如：5完整版pptHBsAg试剂特点

（检测模式：临2、基因工程较早用于免疫测定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,这两种基因工程抗原的出现，较好地解决了抗HBc和HBe的测定问题。因为要从病毒本身去大量获取这两种纯抗原较为困难，并且这一点对于难培养的病原微生物来说，如HIV、HCV和梅毒螺旋体等都有些共性。6完整版ppt2、基因工程6完整版ppt2.1HCV-ELISA试剂HCV目前尚不能体外培养，只能用基因工程或化学合成方法获取HCV结构和非结构区的各种抗原片断，已知HCV基因组有7个功能区组成：核心、E1、E2/NS1NS2NS3NS4NS5(有分为NS5a和NS5b)区，合成抗原的优点是易于纯化，特异性好，抗原抗体反应强。7完整版ppt2.1HCV-ELISA试剂HCV目前尚不2.1.1第一代抗HCV-ELISA试剂盒：由美国ortho公司克隆C1003抗原几个片断与人超氧化物歧化酶（SOD）结合。用酵母从病毒基因组非结合区得到表达，表达为融合蛋白，亦作为包被固相载体。抗原组合：NS4区二个基因片断为NS5-1-1和C1003特性：IgG抗C100在发病后数月后，才检出，故不宜作早期诊断。约由20%的病人不出现抗体。IgM抗-C100急性期检出率只有64%。C100的抗原性较弱，在HCV复制中，不能充分暴露宿主的免疫系统。特异性和灵敏性较差。8完整版ppt2.1.1第一代抗HCV-ELISA试剂盒：8完整版ppt2.1.2第二代HCV-ELISA试剂盒用基因重组的HCV结构蛋白与非结构蛋白抗原包被固相载体。抗原组合：核心区（C区）多肽C22NS区多肽C33C1003和NS5-1-1增加C22区和C33区后，抗体出现早，有助早期诊断，提高阳性率。有利早期诊断。C22是早期易出现病毒血症9完整版ppt2.1.2第二代HCV-ELISA试剂盒9完整版ppt2.1.3第三代HCV-ELISA试剂盒人工合成多肽抗原，由36个氨基酸组成的Cp9(内壳蛋白)和19个氨基酸组成Cp10混合包被固相载体。抗原组合：除有C100-3C22C33外又增加了core和NS3NS4NS5特点：

*coreNS3NS5由Baculovirus重组表达，没有非特异性的载体，试剂特异性高，重组的蛋白经融合形成大分子抗原，利于提高检测灵敏度。

*NS3区增加了氨基酸片断（比例十分重要）。改进了反映的灵敏度。

*NS5经优化，徐去了非特异性的区域（G-D-D）NS3NS5是血转化最早测得的抗体，提高了诊断的准确性。

*NS4为俩个片断的合成多肽，去掉了非特异性反应的区域，加强了试剂的灵敏度和特异性。10完整版ppt2.1.3第三代HCV-ELISA试剂盒10完整版ppt2.1.4第四代HCV—ELISA试剂盒美国新近推出一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白，称为多决定基融合抗原，采用表面活性剂处理分界病毒表面复合物，释放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，灵敏度可达500拷贝/ml，已接近核酸扩增检测水平。抗原组合：以Core和NS3作为主要检测片断（比例十分重要）加合成多肽NS4特点：直接测Core抗原不易发生变异抗IgM和IgG检出率可达100%特异性达99.8%灵敏度为100%11完整版ppt2.1.4第四代HCV—ELISA试剂盒美国新近推出一种包3、基因工程抗体及其功能试剂80年代后人们开始使用基因工程技术制备抗体，并进而将抗体分子片断与其它蛋白（或另一种抗体分子）融合得到多功能试剂，到目前为止，基因工程抗体在免疫测定上的应用尚处于一个初级阶段。且主要是将抗体与其它蛋白以融合蛋白形式表达而得到多功能试剂，如澳大利亚学者应用基因工程技术制备了抗人红细胞抗体与HIV-1gpN41的融合蛋白。这种重组蛋白，即基因工程双功能试剂，在此基础上，建立了快速，灵敏和特异的自身红细胞凝集试验（AGEN）.12完整版ppt3、基因工程抗体及其功能试剂12完整版ppt3.1HIV-ELISA抗原/抗体试剂1998年,美国首先研制第四代试剂,对检测HIV的同时检测P24(核心)抗原,故称HIV抗原/抗体试剂,国内已有引进.抗原组成:gp160gp36gp170和单克隆抗p24抗体包被.13完整版ppt3.1HIV-ELISA抗原/抗体试剂1998年,美国首3.1.2P24抗原测定采用夹心法ELISA,即将将纯化的已知抗体包被，当加入带测血清后，若血清中含有P24与包被抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶（HRP）标记HIV抗体。在抗原上又结合了酶标记的抗体，加底物显色后在酶标仪上读结果。近来为提高检测血清中P24抗原的敏感性，将血清中免疫复合物（ICD)解离后再进行测定。发展了（ICD)P24抗原测定技术。14完整版ppt3.1.2P24抗原测定采用夹心法ELISA,3.1.3抗HIV-ELISA试剂目前对HIV的检测原料有了较大改进，主要如下：（1）可用于检测血清或血浆中HIVIgM亚特异性抗体和检测HIV-1、2和多种亚型。（2）标记的抗原：a.含HIV-1B亚型gp41和P24的HIV-1重组融合蛋白。b.可特异性检测血清或血浆中HIVM群的抗体，绝大多数HIV-1.0群和HIV-2群的抗体。c.gp36免疫调控区的HIV-2多肽可测定特异性的HIV-2抗体。d.gp41的俩段HIV1.0群多肽，可测特异性HIV1.0群的抗体和HIV1M群的抗体。15完整版ppt3.1.3抗HIV-ELISA试剂目前对HIV的检测原料有了。从以上抗原设计保证HIV的来自不同亚型/或区域的抗原亚型抗体的检测。减少了变异株的漏检。HIV-1.0.2对759份各类临床样品包括401份HIV-1感染不同阶段病人样品，204分HIV-2感染不同阶段病人样品，和154份与HIV无关的其他疾病患者的样品的检测结果。特异性：99.93%灵敏度：100%对欧洲血液中心的8842份常规鲜血者样品用HIV-1.0.2进行评价筛选，并经确认实验获得的结果。16完整版ppt。16完整版ppt3.1.4HIV确认试剂—免疫印记

（WB或RIBA）试剂判断标准我国HIV抗体阳性：至少二条膜带（即gp160/gp120）或至少一条膜带和p24(核心)带同时出现美国HIV-1阳性（任何两个中有二条带（P24gp41gp120/gp160）,HIV-2无阳性WHO:HIV-1阳性（不管有无核心带或酶带，但有两条膜带）HIV-2阳性（不管有无核心带或酶带，单有两条膜带即为阳性）17完整版ppt3.1.4HIV确认试剂—免疫印记

4、基因工程酶及其融合蛋白除了基因工程抗原、抗体外，与标记免疫测定有关的另一中重要的基因工程试剂就是酶及其融合蛋白，以重组酶建立免疫测定方法较为成功的是CEDIATM均相酶免疫试验。使用基因工程酶技术生产免疫测定标记酶，是得到符合标记要求的高纯度酶的一条新途径，但如以其他蛋白（抗原或抗体）融合的方法，不但避免了繁琐且低效率的酶与蛋白的化学交联，而且无需得到纯化的酶和抗原或抗体。随着分子生物学技术的发展，将有越来越多的酶免疫测定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基础之上。18完整版ppt4、基因工程酶及其融合蛋白18完整版ppt发展趋势如下：1）、由单一病原蛋白向多决定簇融合蛋白转变，并尽可能包括病原体基因组功能区的所有的能引起肌体免疫应答的决定簇。2）、表达的抗原将尽可能少含有非特异性抗原或共同抗原。3）、为某一目的如病原体基因型确定而设计表达特定的多肽抗原片断。总之，将围绕改善免疫测定的特异性和敏感性来制备基因工程片断。19完整版ppt发展趋势如下：19完整版ppt二、试剂盒的方法学设计目前，ELISA的测定模式，主要有双抗体夹心法测定抗原，如HBsAg,HBeAg,AFP,HCG等；间接法测定抗体如HCV,抗HIV等；双抗体夹心法测抗体如HBs，竞争法测抗体，如HBe,抗HBc等；竞争法测抗原，如激素等小分子。固相捕获法测IgM抗体等，这里只简述双抗夹心法测抗原。目前有一步法和二步法之分。20完整版ppt二、试剂盒的方法学设计目前，ELISA的测定模式，1、HBsAg-ELISA法：1.1一步法：在加入待测物的同时加入酶结合物一起温育，一步即完成反应过程，一步法ELISA的反应曲线为钟型曲线(见图1)，也就是说测定随着待测物中抗原浓度的增加而升高至一定后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(HOOKeffect)，也就是我们在免疫沉淀实验中所称的“带现象”。一步法的反应平衡式如下：Ab+Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*+Ab·Ag+Ag·Ab*+Ab*·Ag·Ab*

(a)(b)(c)(d)21完整版ppt1、HBsAg-ELISA法：1.1一步法：在加入待测其中a为最后测定结果的显色源，当待测物中Ag浓度增加时，无疑会使b,c,和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*,使a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟型曲线，而且由于d复合物的形成，使得在同样的Ab*浓度下，一步显色较二步法为浅。目前一步法所出现“钩状效应”，现已有进展，即采用包被为一种抗体，酶标记用空间距离较远的决定簇的抗体，同时在操作中充分混匀反应液，并适当延长温育时间，则可使b,c和d复合物减少到最低程度，而不出现“钩状效应”22完整版ppt其中a为最后测定结果的显色源，当待测物中Ag浓度增加时，无疑图1一步法ELISA抗原浓度与显色

变化的反映曲线23完整版ppt图1一步法ELISA抗原浓度与显色

二步法：随着待测物中抗原浓度的逐步增加，将使固相抗体与抗原的结合逐步达到饱和(见1式)，这样在一定浓度Ab*的存在下，Ab·Ag复合物的形成将直接与Ab*结合(见2式)，抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，而形成S形变化曲线(见下图2)：Ab+Ag→Ab·Ag(1)Ab·Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*(2)综上所述，一步法ELISA试剂盒作为适合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大市场，其虽有潜在缺陷，易导致高浓度待测物的标本检测为假阴性，但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体的仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。24完整版ppt二步法：随着待测物中抗原浓度的逐步增加，将使固相抗体与抗原的图2二步法ELISA抗原浓度与显色

变化的反映曲线25完整版ppt图2二步法ELISA抗原浓度与显色

灰区概念：合并二种方法一步法试剂其反应平衡点为图中反应曲线A点,处在抗原抗体反应的上坡图中，故受反映条件的改变而影响A值二步法抗原抗体反应已达反应的平台期从图见一步法A点则受反应条件的改变而影响A值。因此出现△Al(可能是假阳性)，△A2(可能是假阴性)。因此将A1—A2间的区域称为灰区。26完整版ppt灰区概念：合并二种方法一步法试剂其反应平衡点为图中反应曲线A

灰区的设置有二种方法：1、以试剂批内CV值（一般为15%左右）设定，灰区范围为CO（1+CV）2、以试剂盒用临界值血清测定S值来设定，公式为CO+2S。以上一般以S值确定的灰区范围比CV值确定值要大。凡灰区范围内的结果可报告可疑或重复检测。27完整版ppt27完整版ppt2.HIV检测法目前市场上也有一步法和二步法两种。，一步法存在以下三个问题：①钩状效应（HookEffect）：有漏检倾向28完整版ppt2.HIV检测法目前市场上也有一步法和二步法两种。，一步法存②HIV-2型抗体的检测：P19、P20两个HIV-2型抗体强阳性标本的检测中，二步法试剂盒OD值至少比一步法试剂高出3~5倍。29完整版ppt②HIV-2型抗体的检测：P19、P20两个HIV-2型抗（3）.本底与一步发试剂盒相比，因二步法试剂盒标本孵育时间长。酶结合物反应充分，特异性强，不仅抗HIV-1、2型阳性标本OD值比一步法高而且本地清晰。一般二步法本地<0.02。30完整版ppt（3）.本底与一步发试剂盒相比，因二步法试剂盒标本孵育时间长三、仪器的质量控制随着全自动生化分析仪的不断更新发展，目前国内已有多家引进先进的自动化酶免疫分析仪来替代ELISA法的手工操作，使试验的特性更加全面规范化。1、全自动酶免分析仪的特点①、加液的精密度：②、始终如一的洗涤：③、环境控制：④、QC特性/过程安全性31完整版ppt三、仪器的质量控制31完整版ppt2、酶标仪的简易校准和质量控制移液器水浴箱洗板机32完整版ppt2、酶标仪的简易校准和质量控制32完整版ppt酶标仪的简易校准和质量控制滤光片波长精度检查通道差和孔间差检测零点漂移即仪器稳定性观察精密度评价线性测定双波长测定评价33完整版ppt酶标仪的简易校准和质量控制33完整版ppt四、开展质量控制前的准备检验工作的质量控制应包括实验室工作的全过程，只有建立在完善的质量管理工作基础之上，才能对测定结果进行质量控制。没有健全的实验室质量管理、质量体系，一切均在非控制之中，只靠一份质控血清，分析这份血清的质控结果是达不到质量保证的预期结果的，也不可能做好室内质控，作好质控图。34完整版ppt四、开展质量控制前的准备检验工作的质量控制应包括实验室工作的1、建立质量体系建立质量管理，编制质量手册，健全质量体系，使实验室的工作有条不紊，从样品采集、运送、记录、检测方法的选择、试剂、仪器、人员素质、操作技术水平、计算、质控方法、报告填写、实验环境、工作量、相互协作等等，每一步骤都准确按质量手册的规程办，可预防差错，即使偶尔发现失控，就能容易地分析出产生变异的因素。35完整版ppt1、建立质量体系建立质量管理，编制质量手册，健全质量体系，使2、质控血清的制备各实验室可以按美国CAP或国家检定新的标准建立起定值质控品制备方法：（1）收集血清（2）灭活（3）离心或过滤除去沉淀物（4）稀释（5）保存（6）定期校正36完整版ppt2、质控血清的制备各实验室可以按美国CAP或国家检定新的标准HBsAg标准曲线图12510ng/ml2.01.037完整版pptHBsAg标准曲线图1253质控物定值的选择室内质控点的选择，以需要设置质控的点，设置质控物进行质控为原则。病毒性肝炎酶免疫检验中，有高值、中值、低值的质控物，我们认为其中以低值的质控物为最重要，设置临界于cutoff值（CO值）的低值弱阳性质控物是室内质控的关键。重点抓住低值弱阳性-临界值血清的室内质控检测，是室内质控精密度观测的最敏感的窗口，也是揭示试验成功与否的重要标志。38完整版ppt3质控物定值的选择室内质控点的选择，以需要设置质控的点，设置临界值血清是室内质控血清，不是判断阴、阳性的标准，判断样品不是判断阴、阳性结果的标准是以试剂盒说明书提供的cutoff值为标准。任何人不能随意更改试剂盒说明书中提供的判断阴、阳性结果的公式。39完整版ppt临界值血清是室内质控血清，不是判断阴、阳性的标准，判断样品不4、cutoff(CO)值又称临界值

或阳性与阴性界限值CO值计算实例：（以夹心法为例）1）依据试剂盒说明书规定S/N≥2.1为阳性.（S:样品，N：阴性对照）因为S≥N×2.1判断为阳性,所以S=N×2.1为阴阳性结果分界点，即CO值.CO(cutoff)值=N×2.1当S≥CO值时，判为阳性；S<CO值时，判为阴性2）样品结果表示法：S/CO值S/CO=样品A值÷CO值当S/CO≥1时，判为阳性；S/CO<1时判为阴性。40完整版ppt4、cutoff(CO)值又称临界值

CO值计算实例：ELISA-抗HBc（竞争抑制试验）依据试剂盒说明书规定：（1）S/N≥2.1为阳性.（S:样本，N：阴性对照）所以S≤N÷2.1，判断为阳性,当S=N÷2.1为阴阳性结果分界点，即CO值.CO(cutoff)值=N÷2.1当S≤CO值时，判为阳性；S>CO值时，判为阴性（2）样品结果新表示法：S/CO值当S/CO≤1时，判为阳性；，S/CO>1时，判为阴性。

**每天检验常规样本时带入临界值血清，进行每日（日间），每块板（板间）的监测，观察其灵敏度，这对盒试剂的质量检验是十分重要的。41完整版pptCO值计算实例：ELISA-抗HBc（竞争抑制试验）每块版放置临界CO值血清做试剂盒质检是十分简便可行的事。5、试剂盒的质检42完整版ppt5、试剂盒的质检42完整版ppt五、室内质控步骤根据英国Whitehead的意见，室内质控分为以下几个阶段：1、最佳条件下的变异(optimalconditionvariation,OCV)2、常规条件下已知值质控血清的变异

(routineconditionvariation-known,RCVK)3、常规条件下未知值质控血清的变异

(routineconditionvariation-unknown,RCVu)4、病人结果的资料统计应用

(statisticsuseofpatient’sresults)43完整版ppt五、室内质控步骤根据英国Whitehead的意见，室内质控分1、最佳条件下的质控血清变异测定在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20~30次，将测得结果计算，求出该组数据的均值（x）和标准差(s)表示该实验室的最佳条件下质控血清变异。举例说明HBsAg-ELISA法检测时OCV的测定。44完整版ppt1、最佳条件下的质控血清变异测定在本实验室最佳条件下（包括操使用的质控血清HBsAg临界值血清。在实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门测定，选用最佳的试剂盒，检测之前应将恒温箱、加样器等认真校正、调试，使用新的加样吸头等，即在最佳、最理想地条件下进行检测，测定阴性对照品和阳性对照品，质控血清做双测定，得出2个吸光值（A值）的均值。获得X1……X20.通过计算S/CO值计算，获20个S/CO值。这组数据举例见表2.145完整版ppt使用的质控血清HBsAg临界值血清。在实验室中选择素质最好、次数质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO值A值A值阴性A值X2.110.1800.0500.1051.7120.1900.0500.10518130.1800.0500.1051.7140.1850.0500.1051.7650.1950.0500.1051.8660.2050.0500.1051.9570.2150.0500.1052.0580.1700.0500.1051.6290.4730.0500.2102.25100.1400.0500.1051.33110.2150.0500.1052.05120.2050.0500.1051.95130.1800.0500.1051.71140.1700.0500.1051.62150.1160.0500.1051.10160.1850.0500.1021.76170.2050.0500.1051.958180.1700.0500.1051.62190.1900.0500.1051.81200.2000.0500.1051.9046完整版ppt次数质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO值A值A值通过表2.1，计算20各质控血清的s/co值的均值（X），标准差（s）和变异系数（cv）：X=1.78s=0.25cv=14.3%从而获得该实验室OCV测定数据。47完整版ppt通过表2.1，计算20各质控血清的s/co值的均值（X），标2、常规条件下已知值质控血清变异做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。仍以HBsAg为例，检测2ng/ml的质控血清，结果和计算见表2.248完整版ppt2、常规条件下已知值质控血清变异做常规检验的技术人员，在常规次数质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO值A值A值阴性A值X2.110.2500.0500.1052.3820.1800.0500.1051.7130.2900.0500.1052.7640.3100.0500.1052.9550.1600.0700.1471.0960.1500.0800.1680.8970.2700.0500.1052.5780.4000.1000.2101.9090.2700.1200.2521.07100.1000.0900.1890.53110.3530.0500.1053.36120.1600.0700.1471.09130.1100.0400.0841.31140.1200.0300.0631.90150.2700.1200.2521.07160.3500.1100.2311.52170.2200.0900.1891.16180.3700.1000.2100.33190.5000.1500.3151.59200.4100.0900.1892.1749完整版ppt次数质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO值A值A值通过表2.2，计算20各质控血清的s/co值的均值（X），标准差（s）和变异系数（cv）：X=1.67s=0.82cv=49.1%这组数据中的s值变异太大，s值为0.82已经3倍于ocv的s0.25，不予接受。一般RCV的S值在OCV的S值的两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向ocv的s值靠近。在改进实验条件后（例如校正加样器，纠正洗板操作，调整温育温度等），重新进行RCVK的测定结果，其结果见标2.350完整版ppt通过表2.2，计算20各质控血清的s/co值的均值（X），标次数质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO值A值A值阴性A值X2.110.1800.0500.1051.7121.1900.0500.1051.8130.2000.0500.1051.9040.2280.0600.1261.8150.1370.0600.1261.0960.2210.0500.1052.1070.1500.0500.1051.4380.1700.0500.1051.6290.1800.0400.0842.14100.1500.0500.1051.43110.2000.0500.1051.90120.1420.0500.1051.35130.2100.0500.1052.00140.2210.0500.1051.52150.1800.0500.1051.71160.1900.0500.1051.81170.1600.0500.1051.52180.2210.0500.1052.10190.2100.0500.1052.00200.1500.0500.1054.1351完整版ppt次数质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO值A值A值通过表2.3，计算20各质控血清的s/co值的均值（X），标准差（s）和变异系数（cv）：X=1.72s=0.29cv=16.9%这组数据中的s值变异太大，s值为0.29有明显改善，已经接近ocv的s0.25。符合要求。如果RCVK的值比OCV的S值更小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新测定OCV。52完整版ppt通过表2.3，计算20各质控血清的s/co值的均值（X），标3、常规条件下未知值质控血清变异的测定有时为了避免主观性，再做RCVU测定。测定步骤同RCVK，但测定的操作者不知质控血清的定值；或在操作者不知道哪一份是质控血清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。53完整版ppt3、常规条件下未知值质控血清变异的测定有时为了避免主观性，再4、质控图54完整版ppt4、质控图54完整版ppt次数日（月、日）质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO值A值A值阴性A值X2.1217.40.1600.0500.1051.52227.70.19000.0500.1051.81237.80.2000.0500.1051.90247.110.2280.0600.1261081257.120.1390.0500.1261.10267.150.2210.0500.1052.10277.160.1500.0500.1051.43287.180.1700.0500.1051.62297.190.2250.0500.1052.1455完整版ppt次数日（月、日）质控血清1阴性对照品Cut-off值S/CO室内质控图示例56完整版ppt室内质控图示例56完整版ppt5、病人资料的统计1.正常人群的S/CO值分布统计2.阳性阳本的S/CO值分布统计3.以阴性和阳性阳本的X和S，分别做质控图57完整版ppt5、病人资料的统计1.正常人群的S/CO值分布统计57完整版6、统计学计算方法——“即刻法”质控

（Gribbsit法）ELISA有其特殊性，最合适的质控方法尚待研究建立．有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELISA试剂盒效期短，同一批号试剂盒连续常规测２０次，难度较大，采用即刻法质控统计方法，只需连续测３次，即可对第３次检验结果进行质控．具体计算方法如下：（１）先将测定值从小到大排列：Ｘ１．Ｘ２．Ｘ３－Ｘn（Ｘ１为最小值，Ｘn为最大），总计算出Ｘ和Ｓ值．58完整版ppt6、统计学计算方法——“即刻法”质控

（２）计算ＳＩ上限值和ＳＩ下限值． Ｘ最大值-XＳI上限＝－－－－－－－ ① ＳＸ－Ｘ最小值ＳI下限＝－－－－－－－－②Ｓ（３）将ＳＩ上限．ＳＩ下限与ＳＩ值表中的数字比较59完整版ppt（２）计算ＳＩ上限值和ＳＩ下限值．59完整版ppt表４:ＳＩ值表nn3sn2snn3sn2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.712.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56ＳＩ上下限值＜n2s在控n2s＜ＳＩ上下限有一值＜n3s告警 ＳＩ上下限有一值＞n3s失控表中数值适用于吸光度．ELISA法的Ｐ／Ｎ值．浓度值（如Ｉg类）滴定的对数值或细胞计数值等．60完整版ppt表４:ＳＩ值表60完整版ppt（４）对告警．失控的测定值均予剔除，并在以后的检测计算时亦不再用．（５）查ＳＩ表时，n次数一定要与相对应的n界值比较，绝不能查错．从以上实例可看出，通过＂即刻法＂统计计算的Ｘ和Ｓ值，与RCV法测得的２０次获得Ｘ，Ｓ是十分接近的．即刻法质控的统计方法，适于免疫学测定的质控．如即刻法已达到20次，就可以做Levey-Jennings质控图。61完整版ppt（４）对告警．失控的测定值均予剔除，并在以后的检测计算时亦不示例：20次质控血清S/CO值次数s/co值次数s/co值11.71121.3521.81132.0031.90141.5241.81151.7151.09161.8162.10171.5271.43182.1081.62192.0092.14201.43101.43211.52111.9062完整版ppt示例：20次质控血清S/CO值次数s/co值次数s/co值1在第三次测定后，按“即刻法”计算：n=3,三次s/co值从大到小排列为：1.711.811.90求出x=1.81,s=0.10计算：SI下限=1.81-1.71=1.00.1SI上限=1.90-1.81=0.90.1查SI值表：n=3时，n2=1.15,n3=1.15。SI下限、SI上限均小于n2sn3s,因此该三次检测数据在控制范围内63完整版ppt在第三次测定后，按“即刻法”计算：63完整版ppt在第四次测定后，按上法计算：n=4测得S/CO值为1.811.711.811.811.90求出x=1.81,s=0.08计算：SI下限=1.81-1.71=1.250.08SI上限=1.90-1.81=1.130.08查SI值表：n=4时，n2=1.46,n3=1.49。SI下限、SI上限均小于n2sn3s,因此该三次检测数据在控制范围内64完整版ppt在第四次测定后，按上法计算：64完整版ppt在第五次测定后，按上法计算：n=5测得S/CO值为1.091.091.711.811.90求出x=1.66,s=0.33计算：SI下限=1.81-1.71=1.730.33SI上限=1.90-1.81=0.730.33查SI值表：n=5时，n2=1.67,n3=1.75。SI下限、SI上限在n2sn3s之间,因此本次检测数据处于“警告”，弃去1.09值。65完整版ppt在第五次测定后，按上法计算：65完整版ppt在第六次测定后，按上5计算：n=5测得S/CO值为2.101.711.811.811.902.10求出x=1.87,s=0.15计算：SI下限=1.81-1.71=1.070.15SI上限=1.90-1.81=1.530.15查SI值表：n2=1.67,n3=1.75。SI下限、SI上限均小于n2sn3s,因此该三次检测数据在控制范围内，继续检测并计算。66完整版ppt在第六次测定后，按上5计算：66完整版ppt当测定达到21次时，因舍去一个数据（第5个），n=20,排序如下：1.351.431.431.431.521.521.621.711.711.811.811.811.901.901.902.002.002.102.102.14X=1.76,s=0.25SI下限=1.76-1.35=1.640.15SI上限=2.14-1.76=1.520.1567完整版ppt当测定达到21次时，因舍去一个数据（第5个），n=20,排序7.1孔间差变异的控制

ELISA检验孔与孔间的差异的调查，可以在同一块板上获取同一份质控血清至少十孔并行试验的S/CO值的均值Ｘ和标准差Ｓ．质控血清HBsAg1ng/ml作孔间变异Ａ值检测，结果如下：0.1250.1030.1030.0980.0920.0990.0980.1060.0980.092Ｘ=1.101S=0.01CV=9.3%通过孔间的变异调查，可以了解不同试剂，不同批号，不同操作者的变异，以便于选择，改进，了解孔间变异，就可以了解每个样品测定值的可能变动范围，对于制定处于ＣＯ值上下的样品的结果是十分有用的．

68完整版ppt7.1孔间差变异的控制

ELISA检验孔与2.2批内变异（板间差异）与批间变异的控制实验室一天需用数块微孔板，这里就存在同一天检测数块板之间的变异（批内变异）和不同天检测之间的变异（批间变异）的问题。如表：69完整版ppt2.2批内变异（板间差异）与批间变异的控制实验室一天需用数块某实验室内质控数据表日期序号12345678s/co值2.243.392.833.252.073.162.502.703.373.061.321.528.003.953.042.513.003.463.793.971.392.011.713.022.132.202.384.268.622.122.972.232.134.012.422.749.223.951.581.981.942.712.914.063.089.832.583.45日期序号91011121314151617s/co值4.657.302.381.902.6312.864.8510.508.806.264.964.133.201.722.634.404.886.906.208.917.682.653.383.195.204.516.102.836.403.023.573.618.919.734.958.597.808.622.886.682.188.532.666.782.643.323.026.88日期序号181920212223s/co值3.379.105.505.814.275.952.602.205.208.614.186.204.472.334.452.775.002.383.699.673.702.804.525.192.812.531.864.804.353.275.272.424.565.909.403.402.872.2970完整版ppt某实验室内质控数据表日期序号12345678s/co值2.2取表2.7中连续20天的每天最大值（x大）和最小值（x小）列表，并计算其值差（x差），求20天值差的均值和标准差，此为批内变异（以x内、s内表示）；取每天数值的均值x，求20天均值的均值和标准差，此为批间变异（以x间、s间）表示，见表2.871完整版ppt取表2.7中连续20天的每天最大值（x大）和最小值（x小）列表2.8某实验室室内质控批内、批间

数值表（S/CO值）第n天最小值最大值值差均值第n天最小值最大值值差均值（X小）（X大）（X差）（X）（X小）（X大）（X差）（X）11.322.240.921.65112.383.571.192.9521.528.006.483.02121.723.812.092.7732.233.951.723.11132.636.914.284.3441.983.161.182.43144.4012.868.467.6151.949.837.893.91152.184.952.774.0062.423.461.042.73166.1010.504.408.0272.584.261.683.28172.898.805.976.3383.069.226.165.40183.279.676.306.1794.658.914.266.71193.706.202.505.13103.027.684.665.53202.809.406.605.3672完整版ppt表2.8某实验室室内质控批内、批间

通过表2.8，计算值差项得出：X内=4.11，S内=2.52计算均值项得出X间=4.52，S间=1.83表2.8，X内（4.11），S内（2.52）为批内变异，X间（4.52），S间（1.83）为批间变异。从该数据反映该室批内变异S内（2.52）大于批间变异S间（1.83）。一般认为批间变异>批内，而事实往往不一定。因必须重视精密度检测水平。73完整版ppt通过表2.8，计算值差项得出：X内=4.11，S内=2.52利用表2.8中的X内和S内做批内变异质控框架图

将X大和X小描纪上，并连成线段，观察批内变异十分直观。74完整版ppt利用表2.8中的X内和S内做批内变异质控框架图

将X大和利用表2.8中X间和S间做室内批间变异控框架图，并将第21次以后的x值依次描记上。在这里，仅利用表2.8中的均值数据x进行范例描记。见图2.5。从图2.4中可以看到，线段长短不等。线段越长，反映精密度越差；线段长的越多，反映这一阶段精密度总体情况不好。线段上上下下不平衡地分布在X轴线的上下两侧，反映出批内变异的偏离也很差。从图2.5中可以看到，前7次数值偏于X轴的下方及第21次到29次，数值呈明显上升趋势，反映出这一段检测处于系统误差之中，应查找原因。75完整版ppt利用表2.8中X间和S间做室内批间变异控框架图，并将第21次7.3个体操作变异的控制当每天检测质控数据按操作者分类计算时，获取每个操作者的日间变异，在日间变异质控图中，描出本室质控曲线变化的同时，用不同颜色，描记出每个操作者质控数值。以了解每个操作者质控结果的变异趋势，用以加强对每个操作者的质控。具体做法，在此不再举例做图了。

76完整版ppt7.3个体操作变异的控制当每天检测质控数据按操作图2.5某实验室批间变异质控图77完整版ppt图2.5某实验室批间变异质控图77完整版ppt8室内质控图的建立及判断8.1Levey-Jennings质控图美国W.A.Shewhart于1924年首先提出质量控制图的统计质控方法，自从Shewhart质控图在工业企业中运用以来，用数理统计的方法监测产品质量的不合格成为可行。使产品的不合格率下降，质量控制成为现实。1949年美国CAP(TheCollegeofAmericanPathologists)。首先开展室间质评(EQA)，从EQA调查中发现许多问题，引起对实验室室内质控的重视。1950年美国学者Levey和Jenning发表第一篇关于医学检验室内质控方法学研究的论文，将Shewhart质控图介绍给临床化学检验室内质控工作中。目前，临床免疫学检验也是采用这种质控图进行室内质控。78完整版ppt8室内质控图的建立及判断8.1Levey-J8.2Levey-Jennings质控图做法以20次质控物的检测结果，计算平均值[X]和标准差(s)，定出控制限。一般以x±2s为警告限，以x-±3s为失控限，做质控框架图。每次(或每天)随病人样本测定的质控物值，标记在质控图上。分析质控图中每天检测质控的结果分布，判断当天检测的样本是否在控制限之列。若当天质控物检测结果失控，则当天病人样本的测定结果报告不能发出。79完整版ppt8.2Levey-Jennings质控图做法以20当以3s为失控限时，每100次约有一次判为失控(99%的合格率)。显然，这个标准太低，使许多失控状态判为合格。当以2s为失控限时，每20次约有一次失控(95%的合格率)，这个标准可以接受。当我们以1.5s为失控限时，就将2/10的结果设定为失控(即约80%的合格率)，显然提高了质控的难度，使操作者需更用心操作，否则易处失控状态。我们建议采用1.5s为失控限。80完整版ppt当以3s为失控限时，每100次约有一次判为失控(99%的合格各实验室选择失控限时，应根据本室条件给予规定。失控限定得太宽(例如定到3s)，几乎不必担心有失控可能，这样常将失控结果误判为合格，使质控失去意义；相反，失控限定得太严(例如定1s为失控限)，使太多的结果，甚至合格的结果，判为失控，这也使质控失去意义。依据本室条件，设定失控限，是室内质控重要的环节。目前，卫生部临检中心提供某些项目室内质控的全国平均变异系数(cv)，各室可以计算出本室质控s的参考值，直接引入质控图中。81完整版ppt各实验室选择失控限时，应根据本室条件给予规定。失控限定得太宽8.3Westgrad多规则控制方法

(以下简称多规则)(1)多规则的构思：前述x±3S和x±2S的控制方法二者在误差出灵敏度和对失控误差识别特异性上有着明显的差，Westgard将它们巧妙地结合起来，并且引进其它控制规则，成了多规则控制方法。目的是提高控制效率，既对误差检出具较好的灵敏度，又对失控误差的识别具较好的特异性。1）在多规则控制方法中，Westgard建议使用2个控制品，浓度一高一低，形成一个范围的控制（没有条件也可只用1个控制品，但有很多局限性）。2）在控制图上绘7条平行线。即：x，x-1S，x+1S，x-2S，x+2S，x-3S，x+3S。便于观察（见附图）82完整版ppt8.3Westgrad多规则控制方法

3）将所有规则以符号表示，便于使用。如x±2S写成12S，x±3S写成13S等，具体含义见下介绍。4）Westgard多规则控制方法中，将12S仅作为警告规则，不是失控规则。充分利用它对误差检出灵敏度高的特点，但又限制了它对误差认别特异性差的弱点。它只指出可能有问题，最后判别要经过系列顺序检查，由其它规则判断。5）经