香菇菌种制作技术规程

DBXX/XXXXX—XXXX香菇菌种制作技术规程1范围本文件规定了香菇（Lentinulaedodes）菌种的术语和定义，生产要求，母种、原种与栽培种生产、检验、入库及留样的技术流程要点。本文件适用于江西省区域香菇母种、原种和栽培种菌种制作要求。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB9688食品包装用聚丙烯成型品卫生标准GB19170香菇菌种GH/T1013-2015香菇NY/T528-2010食用菌菌种生产技术规程NY/T1284食用菌菌种中杂菌及害虫的检验NY/T1731食用菌菌种良好作业规范NY/T1742食用菌菌种通用技术要求NY/T1935食用菌栽培基质质量安全要求GB/T191包装储运图示标志（GB191-2008,ISO780:1997,MOD）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了GH/T1013-2015和GB19170-2003中的一些术语和定义。3.1香菇Lentinulaedodes香菇又名香孽、香信、香苑、冬菇、椎茸(日本)。属担子菌门（Basidiomycota）、伞菌亚门（Agaricomycotina）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Aganicales）、类脐菇科（Omphalotaceae）、香菇属（Lentinus）的一类木腐菌，子实体肉质或近肉质。[GH/T1013-2015，3.1]3.2菌种spawn通过生产试验测试具有特异性、均一性和稳定性，丰产性好、抗性强的香菇菌株或品种，生长在适宜基质上培养物，包括母种、原种和栽培种。3.3母种stockculture经分离、杂交、诱变等各种方法选育得到的具有结实性的香菇菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管和培养皿为培养容器和使用单位，也称为一级种、试管种。[GB19170-2003，3.1]3.4原种motherspawn由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶或（12～17）cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋为容器，也称为二级种。3.5栽培种plantingspawn由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以菌种瓶（玻璃瓶或塑料瓶）或（15～17）cm×（33～35）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋为容器。栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种，也称为三级种。3.6固体菌种solidspawn以富含木质素、纤维素和淀粉等天然有机物为主要原料，添加适量的有机氮源和无机盐类，具一定水分含量的培养基培养的纯菌丝体。3.7液体菌种liquidspawn指采用与母种营养成份相同不加琼脂的液体培养基培养而得到的纯双核菌丝体，菌丝体在培养基中呈絮状或球状，液体菌种可以作为原种或栽培种直接接种在培养袋中。4菌种生产要求4.1人员要求香菇菌种生产所需要的技术人员和检验人员应经过专业培训、掌握香菇基础知识及香菇菌种生产技术规程要求。4.2场所和厂房要求香菇菌种生产应选择地势高、通风良好、空气清新、水源近、排水通畅和交通便利的场所。要求周边300m之内无酿造厂、食用菌栽培场等污染源。香菇菌种生产厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库和配料分装库。配套有配料室、搅拌室、装袋（瓶）室、灭菌室、冷却室、接种室、培养室（通风好，有纱窗）、菌种检测室及菌种冷藏库等各环节的设施。冷却室、接种室和培养室都应要有离子净化设施。4.3生产设备要求香菇菌种生产需要粉碎机、电子秤、搅拌机、装袋（瓶）机、高压锅或常压灭菌锅、离子净化器、超净工作台或接种箱、恒温培养箱、培养架、摇床、液体菌种灌（30L～250L）、冰箱、显微镜等设备。5母种生产5.1菌种生产流程培养基配制→分装→灭菌→冷却→无菌检验→接种→培养→检验→母种5.2容器试管选用18mm×180mm或者20mm×200mm；培养皿选用直径7cm～9cm玻璃培养皿或一次性塑料培养皿。5.3培养基PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。如果配方中的葡萄糖替换成蔗糖，称为PSA培养基。CPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL。可根据实际情况自行选择配方。5.4分装5.4.1试管分装分装培养基至试管1/4处，用棉塞或硅胶塞子封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸或报纸包棉塞，棉线扎紧，棉塞向上放置。棉塞应采用梳棉，不能使用脱脂棉。5.4.2培养皿分装培养基装入300mL～500mL三角瓶至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后灭菌。培养皿用报纸包好灭菌。灭菌后稍微冷却在超净工作台内将三角瓶中的培养基分装至培养皿中，培养基占培养皿高度的1/3～1/2。5.5灭菌放入灭菌锅灭菌，在121℃～124℃（0.11MPa～0.12MPa）下灭菌25min。5.6冷却5.6.1试管冷却灭菌后温度降到（65±5）℃时，在空气清洁的室内摆斜面，要求斜面长度不超过试管长度的2/3。5.6.2培养皿冷却灭菌后温度降到（65±5）℃时，在超净工作台内将三角瓶中的培养基分装至培养皿中，培养基占培养皿高度的1/3～1/2。5.7无菌检验抽取3%～5%冷却的试管或培养皿，在28℃下培养48h，无微生物长出为灭菌合格。5.8母种制备5.8.1超净工作台消毒先用体积分数75%酒精将超净工作台以及接种工具、接种袋(瓶)表面擦拭消毒，再将接种针、接种袋放置到超净工作台上进行紫外照射30min。5.8.2香菇菌种分离挑选生长两天左右、长势良好、形状规则、未开伞、无虫蛀的香菇子实体做为种菇，用体积分数75%的酒精对种菇表面擦洗消毒，并用无菌滤纸充分吸干后放置在洁净的培养皿中。用双手将菇体掰开，用灭过菌的接种刀，在菌盖与菌柄交界处切取10mm×5mm“目”字形组织小块为接种材料。用接种针挑选取一小块组织片，迅速地接入试管斜面培养基的中央，然后将试管口和棉花塞在酒精灯火焰上过火灭菌后塞好，将接种后的试管放入25℃的恒温箱内培养，2d～3d后组织块及周围便长出白色的菌丝，7d～8d菌丝可长满试管斜面。5.8.3转管培养选取斜面上菌丝茁壮、长势优良的试管，用接种针挑取（3～5）mm×(3～5)mm的菌块，按无菌操作要求，转接到新的试管或培养皿培养基中，置于25℃的培养箱中培养15d～20d，当菌丝长满培养基表面，即得母种，可用于生产原种。5.8.4菌种检查接种48h后应做首次检查，挑拣出未萌发或受污染者。母种菌落长至直径约2cm左右时，进行第二次检查，待长满管前再检查一次，剔除或丢弃污染、生长不良的菌种。6原种与栽培种生产6.1生产技术流程培养基配制→装袋（瓶）→灭菌→冷却→接种→培养→检查→原种（栽培种）。6.2固体菌种生产6.2.1培养基配方（1）杂木屑78%、麦麸20%、石膏粉1%、白糖或红糖1%；（2）杂木屑78%、麦麸18%、玉米粉2%、石膏1%、白糖或红糖1%；（3）杂木屑79%、麦麸20%、石膏1%。（2）杂木屑63%、棉籽壳15%、麦麸20%、石膏1%、白糖或红糖1%；（3）杂木屑63%、玉米芯粉15%、麦麸20%、白糖或红糖1%、石膏1%。各地可根据当地原料资源适当调整配方。所有原料应符合NY/T1935规定。6.2.2容器原种采用850mL以下、瓶口直径≤4cm、耐126℃高温的透明玻璃瓶子，或采用（12～17）cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm的聚丙烯塑料袋。栽培种采用同原种要求的玻璃瓶子，或（15～17）cm×（33～35）cm×（0.04～0.05）mm的聚丙烯塑料袋。以上聚丙烯塑料袋均要求符合GB9688《食品包装用聚丙烯成型品卫生标准》要求。6.2.3装袋（瓶）采用装袋（瓶）机或人工进行装袋（瓶），人工装袋（瓶）需用打孔器在袋口处打孔，孔直径1cm～1.5cm，深度为8cm～12cm，每袋（瓶）装培养基500g～600g。6.2.4灭菌培养基质装袋（瓶）后4h内进行灭菌。高压灭菌：组合培养基在121℃～124℃（0.11MPa～0.14MPa）下灭菌2h。常压灭菌：在3h之内使灭菌温度达到100℃，保持100℃10h～12h。6.2.5冷却灭菌完成后取出置于净化冷却区域冷却至室温。6.2.6接种6.2.6.1接种前准备同5.8.1。6.2.6.1接种操作6.2.6.1.1原种接种前一天备好母种，接种时再核对确保无误。严格按照无菌操作要求，将接种工具在酒精灯灼烧灭菌，冷却后挑取菌块2cm～3cm到菌袋(瓶)中，每支母钟接原种6～8袋(瓶)。6.2.6.1.2栽培种接种前一天备好原种，接种时再核对确保无误。严格按照无菌操作要求，将接种工具在酒精灯灼烧灭菌，冷却后挑取5g～6g块状原种到菌袋(瓶)中，每袋(瓶)原种接栽培种60～100袋(瓶)。6.2.7培养温度控制在22℃～26℃，空气湿度在60%~75%，通风避光培养。6.2.8质量检查原种及栽培种在菌丝封口前，每日例行检查。按照NY/T1284要求进行检查。6.3液体菌种生产6.3.1培养基配方见5.3，不加琼脂粉。6.3.2三角瓶液体菌种生产采用150mL～500mL三角瓶，液体培养基添加至刻度的2/3处，并放入3-5个玻璃珠（直径为0.4cm～0.6cm）用带滤膜的封口膜封口后灭菌。灭菌条件同6.2.4。取3mm～5mm大小母种10～15块菌块接种在液体培养基中，在23℃～25℃，振荡频率（搅拌速度）135r/min～145r/min下振荡培养6d～8d。6.3.3发酵罐液体菌种生产条件6.3.3.1装罐和灭菌填装液体培养基至液体发酵罐2/3处，按照液体发酵罐说明书要求，对液体发酵罐和液体培养基灭菌，待液体培养基冷却至30℃以下时进行接种。6.3.3.2接种与培养将培养好的三角瓶液体菌种接入到液体发酵罐中，接种量为培养基总体积的8%～10%，培养温度（23±2）℃，搅拌转速140r/min～180r/min，罐压0.04MPa，通风量0.7N·m3/h。培养5d～7d。6.3.3.3出菇袋接种液体菌种可作为原种或栽培种使用，液体菌种接种在出菇袋中要采用专用液体菌种接种枪进行，严格执行无菌操作，每袋接种10mL～15mL。7检验、入库及留样7.1检验7.1.1抽样质检部门的抽样应具有代表性。母种按品种、培养条件、接种时间分批编号；原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批菌种量的10%、5%、1%。但每批抽样数量不得少于10支（瓶/袋）；超过100支（瓶/袋）的,可进行两级抽样。7.1.2母种检查要求（表1）表1香菇母种感官要求项目要求检验方法容器完整、无破损、无裂纹、洁净肉眼观察棉塞或无棉盖体干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求肉眼观察菌种外观菌丝生长量长满容器肉眼观察菌丝体特征洁白、平整、无角变肉眼观察菌丝体分泌物无肉眼观察菌落边缘整齐肉眼观察杂菌菌落无肉眼观察，必要时使用5×放大镜观察斜面背面外观培养基不干缩，颜色均匀，无暗斑、无色素肉眼观察7.1.3原种感官要求（表2）表2香菇原种感官要求项目要求检验方法容器完整、无破损、无裂纹肉眼观察棉塞或无棉盖体干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求肉眼观察培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50±5）mm肉眼观察菌种外观菌丝生长量长满容器肉眼观察菌丝体特征浓密、生长旺健肉眼观察培养物表面菌丝体生长均匀、无高温抑制线肉眼观察培养基及菌丝体紧贴瓶壁、无干缩肉眼观察菌丝分泌物允许少量无色至棕黄色水珠肉眼观察杂菌菌落无肉眼观察，必要时使用5×放大镜观察子实体原基无肉眼观察7.1.4栽培种感官要求（表3）表3香菇栽培种感官要求项目要求检验方法容器完整、无破损、无裂纹肉眼观察棉塞或无棉盖体干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求肉眼观察培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50±5）mm肉眼观察菌种外观菌丝生长量洁白浓密、生长旺健肉眼观察菌丝体特征生长均匀、无高温抑制线、无原基和菇蕾肉眼观察培养基及菌丝体紧贴瓶壁、无干缩肉眼观察菌丝分泌物允许少量无色至棕黄色水珠肉眼观察杂菌菌落无肉眼观察，必要时使用5×放大镜观察子实体原基无肉眼观察7.1.5液体菌种感官要求（表4）表4香菇液体菌种种感官要求项目要求检验方法容器完整、无破损、无裂纹肉眼观察菌丝生长量培养基1/2～1/3肉眼观察菌丝体特征白色至透明、生长旺健的絮状或球状菌体肉眼观察培养基及菌丝体清澈、无杂色肉眼观察杂菌无杂菌肉眼观察，必要时使用5×放大镜观察7.2入库母种检验完成后应及时入库，详细记录各生产环节（分别记录各级菌种的接种、长满、检验、入库的时间），库房温度应该1℃～6℃，避光，适当通风，但应该对空气进行杀菌处理。香菇母种在库中贮存时间不应长于50d，贮存时