荧光显微成像技术和应用

关于荧光显微成像技术和应用原理

普通光学显微镜通过普通光源的照明观察标本第2页,共16页，2024年2月25日，星期天荧光显微镜(fluorescencemicroscope)：

利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)，用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位置。第3页,共16页，2024年2月25日，星期天荧光显微镜的种类透射式落射式第4页,共16页，2024年2月25日，星期天

目镜吸收滤色镜

物镜暗场聚光镜激发滤色镜

汞灯透射荧光显微镜原理图标本第5页,共16页，2024年2月25日，星期天汞灯激发滤色镜分色镜吸收滤色镜物镜

标本落射荧光显微镜原理图第6页,共16页，2024年2月25日，星期天

透射式汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜

落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜荧光显微镜的主要部件第7页,共16页，2024年2月25日，星期天分色镜反射激发光，透过荧光暗场聚光镜来自下面光源的光线经过暗场聚光镜，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的第8页,共16页，2024年2月25日，星期天荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像具有：形态学特征和荧光的颜色、亮度判断结果时，必须将二者结合起来综合判断

记录结果：主观指标（即工作者目力观察）客观指标（细胞分光光度计、图像分析仪等）第9页,共16页，2024年2月25日，星期天荧光显微镜应用技术1.对细胞结构或组分的定性位、半定量研究免疫荧光技术用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技(directimmunofluorescenttechnique)”。用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirectimmunofluorescenttechnique)”。第10页,共16页，2024年2月25日，星期天由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位第11页,共16页，2024年2月25日，星期天2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。绿色荧光蛋白绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光，在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛用途，包括有第12页,共16页，2024年2月25日，星期天

1.分子标记利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(proteintagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察第13页,共16页，2024年2月25日，星期天2.药物筛选荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针第14页,共16页，2024年2月25日，