细胞工程与基因工程

关于细胞工程与基因工程B

C

A

生物工程的技术体系细胞工程的基本原理基因工程的基本原理细胞工程与基因工程第2页,共38页，2024年2月25日，星期天酶生物活性分子天然细胞天然细胞干细胞工程干细胞工程细胞组织器官个体组织工程组织器官个体生物活性分子发酵工程细胞工程代谢工程分离工程分离工程酶工程采集破碎蛋白质工程途径工程基因工程生物工程的技术体系细胞工程分离工程分离工程第3页,共38页，2024年2月25日，星期天细胞工程的基本原理

细胞工程是指通过组织、细胞、细胞器水平上的筛选和改造，获得具有商业价值的人造组织（器官）、工程细胞株或细胞系，再通过规模化培养，制备特殊产品的技术和过程。细胞工程包括：动植物细胞及组织大规模培养技术动植物细胞融合技术动植物细胞重组技术干细胞技术（组织或器官再生技术，即组织工程）第4页,共38页，2024年2月25日，星期天植物细胞和组织的大规模培养技术基本原理：植物细胞的分化全能性第5页,共38页，2024年2月25日，星期天动物细胞的大规模培养技术基本原理：动物细胞的接触抑制性第6页,共38页，2024年2月25日，星期天动植物细胞融合技术将两种不同性状的细胞在促融剂的帮助下融合在一起，并从中筛选出具有优异性能的杂合细胞。例如，B淋巴细胞具有合成特异性抗体的性状，骨髓瘤细胞具有生长迅速的性状。将两者融合，就能筛选到集两者优点的杂合细胞，即单克隆抗体技术。第7页,共38页，2024年2月25日，星期天细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括细胞核移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等，由此获得具有优良性能的重组细胞株或细胞系动植物细胞重组技术第8页,共38页，2024年2月25日，星期天经历277次乳腺细胞核的移植实验；获得29个发育为八细胞胚；使用13头代孕母亲；生出多莉动植物细胞重组技术第9页,共38页，2024年2月25日，星期天骨髓多能干细胞骨髓细胞淋巴细胞网状细胞红细胞巨核细胞血小板单核细胞巨噬细胞嗜中酸碱性粒细胞B、T淋巴细胞干细胞技术（组织或器官再生技术）第10页,共38页，2024年2月25日，星期天基因工程的基本原理切接转增检第11页,共38页，2024年2月25日，星期天DNA的体外重组：切与接用限制性核酸内切酶切割DNA分子识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点第12页,共38页，2024年2月25日，星期天EcoRI等产生的5’

粘性末端5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP第13页,共38页，2024年2月25日，星期天PstI等产生的3’

粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP第14页,共38页，2024年2月25日，星期天PvuII等产生的平头末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’第15页,共38页，2024年2月25日，星期天DNA的体外重组：切与接用T4-DNA连接酶连接DNA分子修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick第16页,共38页，2024年2月25日，星期天DNA的体外重组：切与接用T4-DNA连接酶连接DNA分子连接多个平头双链DNA分子5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA连接酶第17页,共38页，2024年2月25日，星期天同种内切酶生产的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

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5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第18页,共38页，2024年2月25日，星期天同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

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退火GCCTAGGATCCG5'

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5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

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BclIGCCTAGGATCCG5'

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5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT第19页,共38页，2024年2月25日，星期天同尾酶生产的粘性末端的连接载体质粒BamHISau3AIGGATCCCCTAGGGATCCTAGBamHISau3AISau3AIGATCCGCTAG第20页,共38页，2024年2月25日，星期天不同酶生产的粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGCTGCAGGACGTCGATCCG5'

5'

G5'

GACGTCT4-DNAligase5'

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PstICTGCA3'

GGGATCCCCTAGGBamHICCTAG5'

5'

G5'

GACGTCCCTAGGATCCGCTGCAG5'

G5'ACGTCCCTAGGGATCCCTGCAGG混合退火第21页,共38页，2024年2月25日，星期天重组DNA分子的转化和扩增：转与增物理转化法：钙离子诱导的细菌转化原生质体转化电击转化生物转化法：病毒转染转化细菌接合转化第22页,共38页，2024年2月25日，星期天转化子的筛选和鉴定：检由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。转化子重组子目的重组子第23页,共38页，2024年2月25日，星期天基于载体遗传标记筛选抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori此类筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs

第24页,共38页，2024年2月25日，星期天基于载体遗传标记筛选抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：

先将转化液涂布含有Ap的平板上；再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上。

在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。

ApAp+Tc影印挑选第25页,共38页，2024年2月25日，星期天基于载体遗传标记筛选重组子（Apr+lacZ-）

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal显色筛选法第26页,共38页，2024年2月25日，星期天pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb区分重组子与非重组子用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子基于克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法：第27页,共38页，2024年2月25日，星期天pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb区分目的重组子与非目的重组子用EcoRI酶切转化子质粒DNA：目的重组子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb用PstI酶切转化子质粒DNA：目的重组子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kb基于克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法：第28页,共38页，2024年2月25日，星期天基于目标DNA序列鉴定DNA杂交法影印碱解杂交感光漂洗取膜ATGCCGTATGTGTCATAGCGGCATACACAGGCGTGTAAATGCGCGTAAATTGTCGTAATGCGTAAGCCCCGTGTAAATGTCGACTAT此类筛选法可区分目的重组子与非目的重组子。探针第29页,共38页，2024年2月25日，星期天基于目标DNA序列鉴定PCR扩增法引物A引物B凝胶电泳检测PCR扩增产物A/BAB非重组子重组子目的重组子第30页,共38页，2024年2月25日，星期天目的基因的克隆（分离获得）实现基因工程三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。第31页,共38页，2024年2月25日，星期天目的基因的克隆鸟枪法克隆目的基因cDNA法克隆目的基因PCR法获得目的基因化学合成法获得目的基因第32页,共38页，2024年2月25日，星期天目的基因的克隆鸟枪法克隆目的基因基因文库第33页,共38页，2024年2月25日，星期天目的基因的克隆cDNA法克隆目的基因煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5’ppp’5G

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