酵母粉联合铁剂对小鼠血尿酸的影响

前言高尿酸血症及铁超载尿酸是体内嘌呤代谢的最终产物。正常情况下，人体内的尿酸水平处于稳态，于4~6.8mg/dL之间，研究表明男性尿酸水平持续高于7.0mg/dL或女性尿酸水平持续高于6.0mg/dL则患有HUA。HUA是一种嘌呤代谢紊乱性疾病，是由体内尿酸生成过多或排泄减少所致。目前，随着人们生活质量的不断提高，普遍存在不良的饮食习惯，导致HUA的患病率有显著上升的趋势。HUA是痛风发作的病理基础，与高血压、糖尿病、心血管系统等疾病等有着密切关系[1]。铁作为人体所必需的微量元素之一,当其含量超过正常范围时，会造成各种慢性疾病,甚至加重多种慢性疾病的发展进程[2]。铁超载可分为遗传性铁超负荷和继发性铁超负荷，其中继发性病因可由频繁输血、外源性铁摄入或某些血液病如红细胞生成障碍综合征或慢性溶血性贫血引起[3]。机体内含铁量最多的蛋白是血清铁蛋白，其作为体内铁的一种储存形式，能反映机体铁含量的情况，通常作为判断体内铁含量是否超出正常范围的重要指标。魏景彦[4]研究发现较高水平的血清铁蛋白是HUA及痛风发生的危险因素。目前，人们越来越关注铁超载对人体健康的影响和危害，如何正确选择补铁剂和适量使用含铁保健品以降低铁超载的发生率，不仅是当前医药学界应该重视的疾病治疗问题，也是普通大众应该关注的公共卫生问题。当前,尚未出现有关铁超载对HUA的影响的研究，但有研究发现铁超载与多种疾病有关，如糖尿病、高血压、代谢综合征等[5-7]。高剂量的血红素铁能上调小鼠结肠组织XO的表达水平，增加氧化应激使氧化应激失衡，从而加重结肠直肠癌的发展程度[8]。已有研究表明血清铁及铁蛋白与HUA发病率呈正相关，与血尿酸水平呈弱正相关[9]。随着人们越来越重视对铁超载伴HUA的研究，本文将对铁超载HUA动物模型进行构建和初步评估，进而为研究HUA发病机制和筛选治疗HUA药物提供实验依据。高尿酸血症动物模型研究进展国内外主要采用禽类和啮齿类作为HUA造模的对象，禽类因与人类在尿酸代谢方面有相似之处而被应用，啮齿类则由于在生理生化方面与人类拥有较高的相似性，且具有容易饲养、方便给药、繁殖性强等特点，通常作为新药研究和开发的首要选择[10]。常用于建立HUA模型的方法一般分为：（1）增加尿酸来源：包括给予尿酸前体物质，如酵母、腺嘌呤、次黄嘌呤等，或用沙丁鱼、肉类等高嘌呤食物饲喂。别凤仪[11]通过给予质量分数0.2酵母饲料喂养，致大鼠血尿酸水平与对照组相比显著上升。范红等[12]通过采用在饲料中加入不同比例的高蛋白喂养的方法，成功制备HUA动物模型且无额外副作用。（2）抑制尿酸酶活性：啮齿类具有尿酸代谢酶系统，可以通过尿酸酶的途径将尿酸代谢为尿囊素而及时排出体外，因此采用抑制尿酸酶活性来减少尿酸排泄的方法是建立HUA模型的重要策略。尿酸酶抑制剂的代表药物是氧嗪酸钾，黄元河等[13]通过给小鼠灌胃氧嗪酸钾250mg/kg致尿酸生成增多。（3）抑制尿酸排泄：腺嘌呤、乙胺丁醇等是此类造模药物的代表，但对肾功能会造成一定损伤。张大艳等[14]通过给小鼠连续四周灌胃腺嘌呤75mg/kg，使小鼠血尿酸水平显著升高。（4）多种途径联合造模：此方法可以摈弃单一途径造成的成模效果差的缺点，有效缩短造模时间。Li等[15]使用氧嗪酸钾联合次黄嘌呤腹腔注射的方法连续造模10天后，可以成功复制出类似于人类的急性肾病HUA模型。（5）敲除基因：潘明子等[16]使用尿酸氧化酶基因敲除C57BL/6J小鼠建立自发性HUA模型，该小鼠具有稳定的高血尿酸水平，且能够很好地模拟HUA患者的发病状态，在医学生物学研究中的具有重要的应用价值。目前，国内外对HUA动物模型的应用研究仍处于基础阶段，由于实验动物与人体之间存在异质性，导致构建的模型产生的症状较为单一，当前尚无公认的造模方法和理想符合人体尿酸升高造成HUA过程的动物模型，因此构建一个稳定持续、简便易行、与人类HUA发病机制相似的动物模型至关重要，能够为日后治疗药物的开发、发病机制的研究提供支持。高尿酸血症药物研究现状目前临床治疗HUA的主要方向是降低血尿酸水平，减少尿酸盐的结晶，保护肾脏减轻损伤。对于轻度HUA患者，可以采用非药物治疗方式，即通过控制饮食，选择适当的饮食结构，减少果糖含量较高的食物以及高嘌呤食物的摄入，并进行适量的中等强度运动，使体重维持在正常范围内。对于重度HUA患者，在选择上述非药物治疗方式的同时，还要通过服用药物来减少体内尿酸的产生或(和)促进尿酸的分泌来达到治疗效果。从HUA的发病机制出发，将目前临床常用的降尿酸药物分为四类：（1）抑制嘌呤代谢相关酶的降尿酸药物，如托匹司他、非布司他、别嘌呤醇等；（2）促进尿酸排泄药物，有雷西纳德、苯溴马隆、Dotinurad等；（3）双重抑制降尿酸药物，主要有RLBN1001和KUX-1511两种；（4）尿酸酶类药物，如拉布立酶和普瑞凯希[17]。当前治疗HUA的常用药物均有一定程度的肝肾功能损伤风险,且单一的西药治疗难以达到根治效果,联合用药又会增加不良反应。中医药在辨证论治的基础上遣方用药,在治疗痛风上具有独特的优势，运用整体观念，通过全方位、多靶点的治疗方式，在降低尿酸的同时，还能治疗肾脏损伤等并发症，从而提高患者的身体素质和生活质量。目前临床治疗痛风的常用单味中药有土茯苓、薏苡仁、川牛膝、苍术、黄柏等[18]。除此之外，中药复方也是治疗痛风的选择之一，其作用机理包括多个方面，而抗炎是其治疗痛风的主要方向[19]。邓剑平[20]研究证实，虎贞痛风方通过抑制花生四烯酸途径以及炎性细胞因子和介质而发挥抗急性痛风性关节炎的作用；沈嘉艳[21]实验表明，益肾健脾泄浊汤可有效降低患者血尿酸、血肌酐、尿蛋白、尿中红细胞等的水平；吴燕升等[22]研究表明，矢志方（由车前子、芥子、王不留行和冬葵子组成）不仅能够通过促进尿酸排泄来降低各种病程HUA大鼠的尿酸水平，还能加速脂质代谢，缓解肾小管间质纤维化。目前针对HUA还没有特效药物和方法，临床上通常选择降尿酸的西药来缓解症状，但是其治疗效果是短暂的，且具有多种不良反应。中药逐渐成为大众的选择之一，其在起到治疗效果的同时还具有保护肾脏和肝脏的作用。对于西药，小分子化学药物是当前治疗HUA药物的主要方向。在通过新的靶点、结构、机制进行新药的研究开发或对已有药物进行结构改造修饰的过程中，药物筛选模型的构建都是至关重要的一环。而对于中药及其复方，由于其作用机制的了解和探讨还不够深入，且中药的组成成分复杂，尚不明确成分之间究竟是协同作用还是拮抗作用。因此，提高科研设计的严谨性和整体性，充分结合临床研究，深入发掘作用机制，不断提高中医药治疗HUA的疗效，为新药的研究开发打下坚实基础。酵母粉联合铁剂诱导建立小鼠铁超载HUA模型材料与试剂实验动物SPF级雄性小鼠24只，周龄5周，体重22±2g，购于广东药科大学实验动物研究中心。期间涉及的实验或操作均经广东药科大学动物保护与使用委员会的批准。主要试剂和仪器主要试剂和仪器批号厂家酵母粉LP0021OXOID氯化血红素H140872上海阿拉丁有限公司优利特尿酸/血糖分析仪URIT-10桂林优利特医疗电子有限公司药品配制血红素铁和酵母膏混合液配制：首先用蒸馏水配成1.5g/ml的酵母膏，然后称量约200mg氯化血红素于容量瓶中，加入酵母膏溶液，摇匀，再超声5min，使氯化血红素充分溶解，定容，即可制得20mg/ml氯化血红素酵母膏混合液。实验动物分组及处理将24只小鼠随机划分为3组，对照组、酵母组和酵母联合铁剂组各8只。酵母组每天给予15g/kg酵母膏灌胃，酵母联合铁剂组每天给予200mg/kg血红素铁与酵母膏混合液灌胃，对照组给予等量生理盐水，连续5天。观察指标与测定方法每日在灌胃6h、22h后，使用采血针对小鼠尾部静脉进行采血，后续按照优利特尿酸分析仪的说明书用试纸触碰血样，等待仪器测定血尿酸值。统计学处理所有数据通过SPSS19.0软件进行分析和处理，数值采用平均值±标准差(x±s)的方式来表示。运用单因素方差的分析方法进行不同组之间的对比，P<0.05或P<0.01表明统计学差异显著。结果图2-1明显的显示出：单用酵母膏和酵母膏联合血红素铁均能明显升高小鼠血尿酸值，且两者小鼠血尿酸值上升水平不相上下，均比较稳定，波动小。图2-1造模5天内小鼠血尿酸值的变化各组小鼠血尿酸值表明（见表2-1），造模5天后，酵母组小鼠与对照组相比，血尿酸值明显升高，具有统计学意义（P<0.05）；酵母联合铁剂组小鼠与对照组相比，血尿酸值显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05），表明酵母粉联合铁剂诱导小鼠铁超载HUA模型建立成功；而酵母联合铁剂组小鼠与酵母组相比，血尿酸值无统计学差异（P＞0.05），表明铁超载不会影响小鼠血尿酸水平。表2-1灌胃6h后小鼠血尿酸值(x±s，n=8，μmol/ml)组别1d2d3d4d5d对照组171.67±16.07194.67±26.08163.00±32.63158.33±14.43162.33±7.51酵母组311.88±80.72**390.88±68.54**392.63±48.13**345.88±46.24**391.00±49.89**酵母联合铁剂组308.88±79.79**380.50±39.59**402.38±45.23**368.50±67.97**396.25±92.69**注：与对照组相比，*P<0.05或者**P<0.01。讨论本研究在联合酵母膏与血红素铁干预小鼠中，动态观察了铁剂对高嘌呤摄入小鼠血尿酸水平的影响。采用酵母联合铁剂灌胃的方法诱导铁超载HUA，可以使小鼠血尿酸稳定保持在较高的水平上，此方法操作简单、造模时间短，可建立稳定可靠的铁超载HUA动物模型，为日后的HUA模型的筛选提供参考。本研究采用的酵母粉富含蛋白质、膳食纤维、B族维生素等多种物质，在体内分解可以增加含氮的有机碱及磷酸的含量，扰乱机体嘌呤代谢并且能够增加黄嘌呤氧化酶的活性，从而增高血尿酸水平，更符合原发性HUA的发病机理。参考陈光亮等[23]以15~30g/（kg·d）酵母膏连续灌胃1~2周成功复制出小鼠HUA模型，本实验选择15g/（kg·d）的剂量来造模。调研发现，采用饲喂给药的方法造模，会因动物摄食程度的差异而导致药物摄入剂量不均匀，动物血尿酸浓度不稳定；通过注射造模虽然吸收、代谢快捷，但不仅可能会受到首过效应的影响而改变药效，还会削减尿酸水平升高的持续时间；而灌胃给药的途径虽然存在首过效应，对动物也算一种刺激，但损害相对较小[24]。因此本研究选用灌胃的给药方式进行造模实验。构建HUA模型的对象主要是禽类和啮齿类。禽类如鸡、鹌鹑等由于与HUA的病理和临床表现具有较高的拟合度，并且易于饲养、管理、操作而被广泛应用。但由于禽类动物食用饲料时易使饲料泼洒，饲养条件较为特殊，饲养环境要求严格，因而阻碍了禽类模型的应用[25]。啮齿类如小鼠、大鼠等因遗传背景清晰、品种丰富、体型小而易饲养繁殖、与人类有相似的生理生化特性，故本研究采用小鼠作为实验对象。实验中酵母组及酵母联合铁剂组小鼠血尿酸水平先升高后降低，这可能与小鼠体内尿酸酶受高尿酸浓度的刺激而增强活性有关，高活性的尿酸酶能够降解尿酸生成溶解度更高的尿囊素，而尿囊素可以通过尿液排出体外，最终导致血尿酸水平下降。当前，国内外对于铁超载动物模型的研究不多，主要通过腹腔注射右旋糖酐铁和喂养羰基铁粉饲料两种途径构建铁超载模型。目前使用的铁剂分为血红素铁和非血红素铁，其中血红素铁的有效吸收率（15%~35%）高于非血红素铁的有效吸收率(2%~20%)。氯化血红素作为一种生物态铁，属于非极性分子，能直接被肠黏膜细胞吸收，在细胞内经酶作用分解出铁离子，不会产生消化道刺激，是一种良好的铁强化剂和抗贫血药。有研究表明，灌胃高剂量血红素铁（50mg/kg）能上升组织铁含量[8]。因此，本研究选用灌胃氯化血红素来构建铁超载模型。有研究表明，血清铁及铁蛋白与HUA发病率呈正相关，与血尿酸水平呈弱正相关[9]，不过本研究结果却与之不一致，在本研究结果中，酵母联合铁剂组与单用酵母组相比，小鼠血尿酸水平差异无统计学意义（P＞0.05），表明铁超载不会升高小鼠血尿酸水平。陈炜林等[26]通过使营养性贫血患者连续服用血红素铁45d后发现，血清铁蛋白在试验前、后的差异无统计学意义，该试验服用的期限内血清铁蛋白还未升高，其建议在血红蛋白恢复正常的情况下，铁剂治疗应该持续4~6个月，当血清铁蛋白处于正常水平时，可停止使用。根据其文献资料，分析本研究结果可能原因是造模时间较短，短期内血清铁蛋白还未上升，故而表现出对血尿酸水平无影响。因此，酵母联合铁剂造模时，可将血清铁蛋白纳入观察指标，并延长造模时间，从而进一步完善铁超载HUA模型的构建。此外，对于铁剂对小鼠血尿酸的影响以及铁超载是HUA进展的原因还是结果还有待深入研究讨论。综上所述，酵母联合铁剂灌胃小鼠，可引起小鼠血尿酸快速、持续升高，诱导小鼠形成铁超载HUA，可为开展HUA的研究提供稳定的模型。铁超载HUA模型的初步评估材料和方法实验动物SPF级雄性小鼠32只，周龄5周，体重22±2g，购于广东药科大学实验动物研究中心。期间涉及的实验或操作均经广东药科大学动物保护与使用委员会的批准。主要试剂和仪器主要试剂和仪器厂家酵母粉OXOID氯化血红素上海阿拉丁有限公司虎贞清风胶囊广州暨南生物医药研究开发基地有限公司苯溴马隆片宜昌东阳光长江药业股份有限公司优利特尿酸/血糖分析仪桂林优利特医疗电子有限公司药品配制（1）血红素铁和酵母膏混合液配制：首先用蒸馏水配成1.5g/ml的酵母膏混悬液，然后称量约200mg氯化血红素于容量瓶中，加入酵母膏混悬液，摇匀，再超声5min，使氯化血红素充分溶解，定容，即可制得20mg/ml氯化血红素酵母膏混合液。（2）苯溴马隆药液配制:将苯溴马隆片研磨成细粉，加蒸馏水溶解、搅拌均匀，配成1mg/1ml,备用。(3)虎贞清风胶囊药液配制：将虎贞痛风胶囊内的药粉倒出，加蒸馏水溶解、搅拌均匀，配成33mg/ml的药粉混悬液,备用。实验动物分组及处理将32只小鼠随机划分为4组，对照组、模型组、虎贞清风组、苯溴马隆组各8只。除对照组外，其余组均每日给予200mg/kg血红素铁和酵母膏混合液灌胃，对照组给予等量生理盐水，连续5天。造模5天后，虎贞清风组每日给予330mg/kg虎贞清风胶囊，苯溴马隆组每日给予苯溴马隆10mg/kg，其余组给予等量生理盐水，连续9天。观察指标与测定方法每日给药后6h、22h，使用采血针对小鼠尾部静脉进行采血，后续按照优利特尿酸分析仪的说明书用试纸触碰血样，等待仪器测定血尿酸值。统计学处理所有数据通过SPSS19.0软件进行分析和处理，数值采用平均值±标准差(x±s)的方式来表示。运用单因素方差的分析方法进行不同组之间的对比，P<0.05或P<0.01表明统计学差异显著。结果给药9天内小鼠血尿酸值的变化表明（见图3-1）：虎贞清风胶囊和苯溴马隆均能明显降低小鼠血尿酸值，且两者小鼠血尿酸值下降水平相差较小。但各组小鼠血尿酸值不太稳定，波动略大。图3-1给药9天内小鼠血尿酸值的变化各组小鼠血尿酸值表明（见表3-1），给药9天后，与对照组比较，模型组小鼠的血尿酸水平明显上升，具有显著统计学差异（P<0.05）；与模型组小鼠相比，虎贞清风组和苯溴马隆组小鼠的血尿酸浓度均显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；而虎贞清风组和苯溴马隆组小鼠与对照组相比，血尿酸浓度无显著差异；虎贞清风组与苯溴马隆组相比，小鼠血尿酸浓度降低水平差异无统计学意义（P＞0.05），说明虎贞清风胶囊和苯溴马隆对酵母膏联合血红素铁诱导的小鼠铁超载HUA模型具有可治愈性，且两者降低血尿酸的效力相似。表3-1各组小鼠的血尿酸值(x±s，n=8，μmol/ml)组别给药后6h对照组162.62±40.25模型组243.39±38.05*虎贞清风组177.76±37.44#苯溴马隆组185.89±36.03#注：*P<0.05vs正常组;#P<0.05vs模型组。讨论本实验的阳性对照药为虎贞清风胶囊和苯溴马隆。虎贞清风胶囊（又称虎贞痛风胶囊），为暨南大学生物医药研究开发基地研制的中药复方制剂，以车前草、女贞子、蜂房和虎杖4种药材为主要成分，能够清热利湿、化瘀祛浊、养肝肾，对急性痛风性关节炎的关节疼痛有较好的治疗效果，起效时间短，临床应用较安全[27]。它的作用机理可能与抑制炎症反应、降低尿酸浓度有关。利奕成等[28]研究了虎贞清风胶囊治疗急性关节炎的作用机理，以家兔为模型，观察到给药组的白细胞值比模型组少，能有效抑制炎症反应。虎贞清风胶囊的作用机理还有待深层次的探讨。苯溴马隆是一种使用时间较长的促尿酸排泄药，其主要作用机制是通过抑制肾小管对尿酸的重吸收，增加尿酸排泄来降低血尿酸浓度，在十几天的治疗后能够降低患者的血尿酸浓度至低于6mg/dL，并减少急性痛风的发作，缓解患者的病症。从上述结果可以发现，各组小鼠在给药3天后血尿酸值不稳定，均有不同程度的波动，查阅相关文献后，分析其可能原因有：（1）小鼠对环境较为敏感，实验时间过长则受其他因素的影响越大，因此在构建模型时，严格控制各种环境因素，提高模型的稳定可靠性。（2）各小鼠之间存在较大的个体差异，且血尿酸值的测定具有时效性，因此要严格把握灌胃后的采血及检测时间。在本实验中我们选用了苯溴马隆和虎贞清风胶囊作为阳性对照药，来确保本实验的客观性。为证明采用酵母联合铁剂的方法所诱导的铁超载HUA模型在药物筛选中的作用，在研究中观察了虎贞清风胶囊和苯溴马隆对模型尿酸水平的影响。从结果中可以发现，虎贞清风胶囊和苯溴马隆均能明显降低模型的尿酸水平。综上所述，虎贞清风胶囊和苯溴马隆可作为缓解铁超载HUA模型的合适药物，可应用该铁超载HUA模型对HUA进行实验研究。总结与建议总结结论灌胃酵母联合铁剂可成功建立较理想的小鼠铁超载HUA动物模型，其血尿酸值水平较对照组小鼠明显升高。虎贞清风胶囊和苯溴马隆能够降低酵母联合铁剂诱导的铁超载HUA动物模型的血尿酸水平，说明此模型能够作为筛选降尿酸药物的动物模型，此外还可以帮助探索药物的可能作用机制。创新点本实验基于较高水平的血清铁蛋白是HUA的危险因素的研究结果，选择模拟人类HUA和铁超载发病的饮食习惯，通过血红素铁联合酵母膏灌胃诱导铁超载HUA小鼠模型，希望为铁超载HUA动物模型的制备创造新的方法，并为深入研究铁超载在HUA发病机理中的意义和HUA治疗药物的研究开发提供新的HUA动物模型。不足之处本研究未发现血红素铁对小鼠血尿酸水平的影响，与现有的研究结果不相符，铁剂在尿酸代谢过程中参与的角色未探明，仍需要在后续的实验中深入探究。本研究观察周期较短，只是将血尿酸值作为观察指标来进行研究，今后要采用多种观察指标，如小鼠表观体征、血清铁蛋白、血肌酐等，对模型的指征进行生化及病理学上的检测，从不同侧面研究铁超载HUA的病理特点。建议大多数HUA患者无法根治，我们不仅要关注机体血尿酸水平，还可以增加对易患人群体内铁含量的检测，以便及时诊断并采取相应的预防措施，从而降低HUA的发生率。HUA患者应进行适当的中等强度有氧运动，控制高嘌呤食物摄入的同时，选择性摄入一些深色蔬菜和果糖含量低的水果。对于需要补铁的患者，应正确使用补铁剂和适当选择含铁保健品。参考文献[1]庞敏霞,方颖莹,陈素红,等.高尿酸血症的危害及中药防治特点的研究进展[J].中华中医药学刊,2017,35(2):340-344.[2]李华成,邵志林,刘文涛,等.非酒精性脂肪性肝病患者血清铁蛋白水平变化及临床意义[J].中西医结合肝病杂志,2017,27(4):215.[3]PalmerWC,VishnuP,SanchezW,etal.DiagnosisandManagementofGeneticIronOverloadDisorders[J].Journalofgeneralinternalmedicine,2018,33(12)：2230-2236.[4]魏景彦.痛风/高尿酸血症患者血清铁蛋白水平与糖脂及嘌呤代谢关系分析[D].青岛:青岛大学,2017.[5]GaoH,YangJ,PanW,etal.IronOverloadandRiskofDiabetesinGeneralPopulation:ResultsfromtheChineseHealthandNutritionSurveyCohortStudy[J].Metabolism,2021,116(S):3-4.[6]甘霓,崔雨婷,周雅婷,等.铁死亡在高血压发病中的作用[J/OL].中国动脉硬化杂志:1-13[2023-03-16].[7]PitchikaA,KühnJP,SchipfS,etal.Hepaticsteatosisandhepaticironoverloadmodifytheassociationofironmarkerswithglucosemetabolismdisordersandmetabolicsyndrome[J].Liverinternational,2021,41(8):1841-152.[8]陈宣承.血红素铁对小鼠溃疡性结肠炎相关癌变的影响[D].无锡:江南大学,2021.[9]WangY,YangZ,WuJ,etal.Associationsofserumironandferritinwithhyperuricemiaandserumuricacid[J].ClinRheumatol,2020,39(12):3777-3785.[10]王琳,沈嘉艳,谢招虎,等.高尿酸血症动物模型研究进展[J].中国实验动物学报,2023,31(1):112-119.[11]别凤仪.果糖联合酵母诱导大鼠高尿酸血症模型及其尿酸代谢机制研究[D].青岛:青岛大学,2017.[12]HongF,ZhengA,XuP,etal.High-Proteindietinduceshyperuricemiainanewanimalmodelforstudyinghumangout[J].IntJMolSci,2020,21(6):1-23.[13]黄元河,黎星星,潘乔丹,等.赤苍藤醇提物的急性毒性及对小鼠高尿酸血症的影响[J].中国民族民间医药,2017,26(5):52-54.[14]张大艳,肖为,陶叶杏,等.海带褐藻多糖硫酸酯对腺嘌呤诱导的小鼠高尿酸血症的拮抗作用[J].天然产物研究与开发,2016,28(3):433-437.[15]LiQ,HuangZ,LiuD,e