硫唑嘌呤片参比制剂溶出曲线测定及方法学考察

前言1.1硫唑嘌呤片硫唑嘌呤（azathiprine）是一个免疫抑制剂ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>贺程程</Author><Year>2023</Year><RecNum>57</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1]</style></DisplayText><record><rec-number>57</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">57</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>贺程程</author><author>郑奕枫</author><author>陈秋三</author><author>青青</author><author>李明松</author></authors></contributors><auth-address>广州医科大学附属第三医院消化内科炎症性肠病中心;</auth-address><titles><title>炎症性肠病相关噬血细胞综合征的研究进展</title><secondary-title>中国中西医结合消化杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国中西医结合消化杂志</full-title></periodical><pages>183-187</pages><volume>31</volume><number>03</number><keywords><keyword>炎症性肠病</keyword><keyword>噬血细胞综合征</keyword><keyword>2型X连锁淋巴组织细胞异常增生症</keyword><keyword>克罗恩病</keyword><keyword>溃疡性结肠炎</keyword></keywords><dates><year>2023</year></dates><isbn>1671-038X</isbn><call-num>42-1612/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[1]，其胃肠道吸收较好，生物利用度较高。硫唑嘌呤片一进入体内就迅速代谢为6-巯嘌呤，后者在体内必须代谢为活性代谢产物而发挥作用，且其在体内的代谢途径也很多，最主要的活性代谢物为硫化次磺苷酸，但代谢速率因人而异。硫唑嘌呤片的临床应用多用于器官移植时引起得免疫排斥反应，以及某些自身免疫综合征。硫唑嘌呤片（azathioprinetablets）为淡黄色薄膜包衣的普通片剂，规格为50mg，商品名为依木兰，由澳大利亚AspenPharmacareAustraliaPtyLtd研制，参比制剂在德国生产。有关硫唑嘌呤片更多的基础信息见表1，参考原研说明书中推荐的免疫治疗方案，通常首日剂量为5mg每日每公斤体重，维持剂量一般为1~4mg每日每公斤体重。2020年，通过CFDA批准在中国上市。硫唑嘌呤片国内上市的规格有50mg和100mg两种，生产100mg规格的厂家除了北京嘉林药业股份有限公司外，国内无其他产业生产；而生产50mg规格的有2家，分别是浙江奥托康制药集团股份有限公司和天方药业有限公司。FDA与1982年1月1日批准硫唑嘌呤片上市，待专利期过，目前美国没有企业在生产硫唑嘌呤片的仿制药。表1硫唑嘌呤片的基本信息性质通用名称硫唑嘌呤片商品名称依木兰；Imuran英文名称AzathioprineTablets汉语拼音LiuzuopiaolingPian化学名称6-【5-（1-甲基-4-硝基-1H-咪唑基）硫代】-1H-嘌呤化学结构式分子式C9H7N7O2S分子量277.27性状圆型、双凸、黄色薄膜衣片规格50mg1.2硫唑嘌呤片在不同标准中溶出度与含量的测定方法硫唑嘌呤片在中国药典2020年版二部、美国药典35版和日本药局方中都有收载，日本药局方与美国药典记载的硫唑嘌呤片含量检测方法的差别见表2，中国药典和美国药典对硫唑嘌呤片含量的测定采用的是高效液相色谱法，但两个药典中的供试品溶液的配置方法并不相同，而日本药局方对硫唑嘌呤片含量的测定采用的是紫外分光光度法；中国药典与美国药典溶出度的检测方法也相同，均才用紫外检测ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>匡荣</Author><Year>2013</Year><RecNum>62</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[2]</style></DisplayText><record><rec-number>62</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">62</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>匡荣</author><author>陈男</author><author>倪维芳</author></authors></contributors><auth-address>浙江工业大学药学院;浙江省食品药品检验研究院;</auth-address><titles><title>HPLC测定硫唑嘌呤片有关物质</title><secondary-title>中国现代应用药学</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代应用药学</full-title></periodical><pages>180-183</pages><volume>30</volume><number>02</number><keywords><keyword>硫唑嘌呤片</keyword><keyword>有关物质</keyword><keyword>高效液相色谱法</keyword></keywords><dates><year>2013</year></dates><isbn>1007-7693</isbn><call-num>33-1210/R</call-num><urls><related-urls><url>/kcms/detail/33.1210.R.20130220.0914.018.html</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.13748/ki.issn1007-7693.2013.02.027</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[2]。本文对测定含量和溶出度的检测方法进行方法学考察，考察检测方法测定硫唑嘌呤的有效性和可行性。1.2.1硫唑嘌呤片在美国药典中的含量测定方法（1）检测方法：高效液相色谱法，色谱条件见表2。表2美国药典中硫唑嘌呤片的含量测定方法的色谱条件色谱条件色谱柱填充剂为L1的4-mm×30-cm色谱柱流动相1-庚烷磺酸钠1.1g溶于700ml水中，加入300ml甲醇，混合。用1n盐酸调节溶液ph为3.5。通过0.8um耐溶剂膜过滤溶液，并脱气，必要时进行调整检测波长254nm取样体积10ul（2）供试品溶液的配制：称量并粉碎不少于20片的粉末。准确称取部分粉末，相当于约50mg硫唑嘌呤，转移到100ml容量瓶中。在烧瓶中加入25ml甲醇和1.0ml氢氧化铵，旋转，超声2分钟。用甲醇稀释至体积，混合。让赋形剂沉淀，将10.0ml上清液转移到50ml容量瓶中，用水稀释至体积，混合。（3）对照品溶液的配制：将约25mg美国硫唑嘌呤RS，准确称重，转移到50ml容量瓶中。向烧瓶中加入约15ml甲醇和0.5ml氢氧化铵，旋转，声波2分钟。取10.0ml本溶液放入50ml容量瓶中，加水稀释至体积，混合。（3）限度标准：硫唑嘌呤片中含有不少于93%，且不超过标示量的107%的硫唑嘌呤。1.2.2硫唑嘌呤片在日本药局方中的含量测定方法（1）检测方法：紫外-分光光度法，于280nm波长处测定供试品溶液与对照品溶液的吸光度。（2）供试品溶液的制备：准确称重，粉末不少于20片硫唑嘌呤片。准确称取一部分粉末，相当于约0.1克硫唑嘌呤（C9H7N7O2S），加入20毫升二甲基亚砜进行紫外-可见分光光度测定，摇匀，加入0.1mol/L盐酸TS，精确至500毫升，过滤。丢弃前20mL滤液，精确测量3mL后续滤液，加入0.1mol/L盐酸TS，精确制成100mL，并将该溶液用作样品溶液。（3）对照品溶液的制备：精确称取约0.1g硫唑嘌呤RS，预先在1059C下干燥5小时，溶于20mL二甲基亚砜中进行紫外-可见分光光度法，加入0.1mol/L盐酸TS，精确制成500mL。精确测量3mL该溶液，加入0.1mmol/L盐酸TS，准确制成100mL，并将该溶液用作标准溶液。（4）限度标准：硫唑嘌呤片中含有不少于95%，且不超过标示量的105%的硫唑嘌呤。1.3小结在仿制药研制的过程中，参比制剂是作为一把标尺而存在，是被仿制的对象，其作为仿制药质量与疗效一致性评价的对照品ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>胡宇</Author><Year>2020</Year><RecNum>71</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>71</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684307262">71</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>胡宇</author><author>宗欣</author><author>于淼</author><author>李勇</author></authors></contributors><auth-address>中国药科大学国际医药商学院;国家药品监督管理局信息中心;</auth-address><titles><title>我国仿制药一致性评价政策环境现状分析</title><secondary-title>中国药物评价</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国药物评价</full-title></periodical><pages>321-326</pages><volume>37</volume><number>05</number><keywords><keyword>仿制药</keyword><keyword>一致性评价</keyword><keyword>政策环境</keyword><keyword>现状</keyword></keywords><dates><year>2020</year></dates><isbn>2095-3593</isbn><call-num>10-1056/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[3]。参比制剂的选择是仿制药研究的重要过程，参比制剂一般为原研药品或国际公认的同种药品，参比制剂地位一般由中检院赋予，中检院会定期更新参比制剂目录或公布拟推荐参比制剂。本论文研究参比制剂硫唑嘌呤片的性质，主要包括溶出曲线、片重差异、含量等，进行硫唑嘌呤片溶出度测定方法和含量测定方法的方法学考察。通过收集参比制剂的资料发现，参比制剂的质量要求比国产的要求更加严格，如参比制剂的含量测定要求为标示量的95%~105%，而国产硫唑嘌呤片的含量测定仅要求为标示量的93%~107%，且发现参比制剂质量标准对杂质控制更加严格，说明原研片在各方面均优于国产药。本论文旨在，为探索硫唑嘌呤片处方筛选与制备工艺的优化而作前期准备工作，研究参比制剂的各方面性质，争取在国内可以早日做出治疗和疗效与原研片更相近的硫唑嘌呤片仿制药，使自制硫唑嘌呤片与参比制剂达到质量和疗效一致性。早在10年前，我国还没有一致性评价这一说法，而那个时候仿制药的质量参差不齐，没有严格的控制系统进行约束ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>宗云岗</Author><RecNum>54</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>54</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">54</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>宗云岗</author></authors></contributors><auth-address>国家药品监督管理局南方医药经济研究所;</auth-address><titles><title>我国药品创新发展趋势分析与建议</title><secondary-title>中国药科大学学报</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国药科大学学报</full-title></periodical><pages>1-16</pages><keywords><keyword>药品创新</keyword><keyword>药物批准</keyword><keyword>研发战略</keyword><keyword>类同新药</keyword><keyword>研发管线</keyword><keyword>差异化竞争</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1000-5048</isbn><call-num>32-1157/R</call-num><urls><related-urls><url>/kcms/detail/32.1157.R.20230508.1411.004.html</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[4]。直至2012年，我国开始了试点品种的仿制药一致性评价，直至今日逐渐落在固体制剂方面已经形成了比较完备的体系。一致性评价是要求在我国上市的仿制药的质量标准尽量向参比制剂去靠ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>郝远</Author><Year>2018</Year><RecNum>76</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>76</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684391723">76</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>郝远</author></authors><tertiary-authors><author>李淑贤,</author><author>方洪壮,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>五种口服固体制剂主辅料的近红外定量分析方法研究</title></titles><keywords><keyword>近红外技术</keyword><keyword>化学计量学</keyword><keyword>定量模型</keyword><keyword>主药</keyword><keyword>辅料</keyword></keywords><dates><year>2018</year></dates><publisher>佳木斯大学</publisher><work-type>硕士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[5]，在质量和药效上达到真正的一致。本论文，亦旨在向硫唑嘌呤片的仿制药一致性评价研究，提供实验基础与参考ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>姚秉成</Author><RecNum>53</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>53</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">53</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>姚秉成</author><author>张花香</author></authors></contributors><auth-address>中国医药集团有限公司;中国医药工业信息中心;</auth-address><titles><title>2022年前三季度我国医药工业经济运行情况分析</title><secondary-title>中国医药工业杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国医药工业杂志</full-title></periodical><pages>1-8</pages><keywords><keyword>经济运行分析</keyword><keyword>医药工业</keyword><keyword>社会与管理药学</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1001-8255</isbn><call-num>31-1243/R</call-num><urls><related-urls><url>/kcms/detail/31.1243.R.20230508.1709.004.html</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[6]。2仪器和试药2.1仪器表3仪器仪器规格生产企业药物溶出仪RCZ-8上海黄海药检仪器有限公司紫外分光光度计UV-2700日本岛津旋转式压片机2P-5B广州晨雕高效液相仪（包括2487紫外检测器、Empower色谱工作站和自动进样器）Waters2695美国Waters公司2.2试药表4试药名称批号/规格采购公司硫唑嘌呤原料药202201020武汉远诚科技发展有限公司硫唑嘌呤对照品100197-201002中国食品药品检定研究院硫唑嘌呤片（商品名：依木兰-京东大药房二甲基亚砜（DMSO）分析纯天津市致远化学试剂有限公司氯化钾分析纯广州化学试剂厂冰乙酸纳分析纯天津市致远化学试剂有限公司6-巯基嘌呤-北京富乐士生物科技有限责任公司硬脂酸镁MGS-W0169上海风泓药用辅料技术有限公司十八酸化学纯南宁师范学院化学试剂厂玉米淀粉180109安徽山河药用辅料股份有限公司磷酸分析纯天津市致远化学试剂有限公司3方法与结果3.1依木兰的质量研究3.1.1性状取硫唑嘌呤片，置白色背景下，在亮光下观察，应为淡黄色圆形片。3.1.2鉴别结果见表5，对照品溶液与供试品溶液的保留时间分别为13.043和13.016，对照品溶液和供试品溶液的保留时间基本一致，故可认为供试品应为硫唑嘌呤。图1供试品溶液所得色谱图图2对照品溶液所得色谱图表5参比制剂硫唑嘌呤片鉴别试验结果（n=2）样品主峰保留时间（min）对照品溶液13.043供试品溶液13.0163.1.3检查项（1）片重差异平均片重或标示片重在0.3g以下时，重量差异限度为±7.5%[7]。结果如表6所示，求得20片的平均片重为157.775mg，硫唑嘌呤片的标示片重为50mg，小于0.3g，且在检查的20片重量差异在±7.5%范围内，片重差异合格。表6参比制剂硫唑嘌呤片的片重差异结果（n=20）序号片重（g）总重（g）/平均片重（g）重量差异(%)10.15983.1555/0.1577751.2820.1560-1.1330.1573-0.340.1540-2.3950.15790.07960.1569-0.5570.1576-0.1180.1567-0.6890.16273.12100.16142.3110.15920.90120.16021.54130.1568-0.62140.1557-1.32150.15780.01160.15780.01170.1569-0.55180.1568-0.62190.15900.78200.1569-0.553.2依木兰的溶出度测定溶出曲线的测定方法通常是取样品6片，使用溶出仪，进行溶出试验，于设定好的时间点（一般不少于6个时间点）取样，得到溶出液，用选定的检测方法进行测定，得到各个时间点的溶出度，进行曲线拟合而得到曲线。溶出曲线用于反映一个药物的体外释放情况ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>叶松华</Author><Year>2023</Year><RecNum>56</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[7]</style></DisplayText><record><rec-number>56</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">56</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>叶松华</author><author>张文琴</author><author>王进东</author><author>王晓燕</author><author>阮文辉</author></authors></contributors><auth-address>山西省药品审评中心山西省医药与生命科学研究院;</auth-address><titles><title>甲硝唑片体外溶出一致性评价</title><secondary-title>山西医科大学学报</secondary-title></titles><periodical><full-title>山西医科大学学报</full-title></periodical><pages>382-387</pages><number>03</number><keywords><keyword>甲硝唑</keyword><keyword>溶出曲线</keyword><keyword>一致性评价</keyword><keyword>相似因子</keyword></keywords><dates><year>2023</year></dates><isbn>1007-6611</isbn><call-num>14-1216/R</call-num><urls><related-urls><url>/kcms/detail/14.1216.R.20230317.1425.014.html</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.13753/j.issn.1007-6611.2023.03.016</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[7]，本论文绘制所得溶出曲线用于硫唑嘌呤仿制药研制时进行对比，考察原研片与自制片是否达到生物等效性，体外释放情况一致是原研片与自制片是否达到一致的一个重要比对指标。3.2.1方法来源照Chp（2020年版二部）硫唑嘌呤片的溶出度测定方法，检测方法为紫外-分光光度法，其溶出度实验的各项条件见表7。表7溶出度试验法溶出条件温度37.0±0.5℃搅拌速度50r·min-1溶出介质水、ph1.2盐酸、ph4.0醋酸盐缓冲液、ph6.8磷酸盐缓冲液溶出体积900ml取样时间点5、10、15、30、45、60min取样体积10ml过滤方法经0.45um滤膜过滤检测方法紫外分光光度法，在280nm处测定吸光度。3.2.2溶出度测定方法的方法学考察（1）线性与范围线性试验是每一个涉及定量测定的测定项目都必须要进行的方法学考察项目，除溶出度测定外，含量测定、杂质定量测定等也涉及定量测定，其方法学考察项目均包括线性。配制系列梯度浓度的供试品溶液，浓度从高到低一次按照硫唑嘌呤片溶出度测定方法进行测定，得到浓度从高到低的一系列吸光度（A），线性试验结果如表8所示，线性回归方程为y=0.0615270+0.00558630,相关系数r2=0.99942，结果表示在硫唑嘌呤浓度为3.0ug/ml~15ug/ml内，浓度与吸光度呈良好的线性关系表8溶出线性关系试验结果（n=6）浓度C（ug/ml）3.04.57.510.51215吸光度（A.）0.1820.2910.4630.6590.7430.924线性回归方程Y=0.0615270x+0.0058630相关系数0.99941图3硫唑嘌呤对照品浓度在280nm处的吸光度的标准曲线（n=6）（3）回收率实验回收率用于表征一个检测方法的准确度，即检测结果与真实值之间的差异，而加样回收法是一个处方量未知的制剂检测方法的回收率测定的实验方法。称取同一批号硫唑嘌呤片样品9份，每份0.01g，采用加样回收法测定。分别加入标示量为80%~120%样品的硫唑嘌呤对照品，将片粉与对应质量的对照品一同放入100ml容量瓶中，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，加水稀释至100ml，从中取出约10ml，滤过。取1ml滤液放入10ml量瓶中，加水稀释到10ml，充分震荡。结果如表9所示，三个浓度水平的平均值的RSD为0.15%，小于2.0%，结果表示本法具有较好的准确度ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>开地尔娅·阿不都热合曼</Author><Year>2022</Year><RecNum>58</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[8]</style></DisplayText><record><rec-number>58</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">58</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>开地尔娅·阿不都热合曼</author><author>张荣赓</author><author>钱浩楠</author><author>邹振洋</author><author>丹尼娅·叶斯涛</author><author>范田园</author></authors></contributors><auth-address>北京大学药学院药剂学系,北京大学药学院分子药剂学与新释药系统北京市重点实验室;</auth-address><titles><title>个性化剂量熔融沉积成型3D打印茶碱片剂的制备和体外评价</title><secondary-title>北京大学学报(医学版)</secondary-title></titles><periodical><full-title>北京大学学报(医学版)</full-title></periodical><pages>1202-1207</pages><volume>54</volume><number>06</number><keywords><keyword>熔融沉积成型</keyword><keyword>3D打印</keyword><keyword>茶碱</keyword><keyword>个性化治疗</keyword><keyword>片剂</keyword><keyword>剂量</keyword></keywords><dates><year>2022</year></dates><isbn>1671-167X</isbn><call-num>11-4691/R</call-num><urls><related-urls><url>/kcms/detail/11.4691.R.20221026.1524.019.html</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.19723/j.issn.1671-167X.2022.06.024</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[8]。表9回收率试验结果（n=9）浓度对照品加入量（w/mg）初始量（w/mg）测得量（w/mg）回收率（%）平均（%）RSD（%）80%2.5403.1755.66799.1699.720.152.5403.1755.716100.022.5403.1755.71399.97100%3.1753.1756.356100.09100.033.1753.1756.32299.563.1753.1756.378100.44120%3.813.1756.97999.9199.903.813.1756.96799.743.813.1756.989100.06（4）溶液稳定性取硫唑嘌呤片按溶解度测定方法进行试验，使溶出液（30min的其中一份）在12小时内放置在室温下，分别于0h、2h、4h、6h、8h和12h取样ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>翟岳玲</Author><Year>2015</Year><RecNum>61</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[9]</style></DisplayText><record><rec-number>61</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">61</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>翟岳玲</author></authors><tertiary-authors><author>王洪权,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>西多福韦凝胶剂的处方、制备工艺及质量研究</title></titles><keywords><keyword>西多福韦</keyword><keyword>凝胶剂</keyword><keyword>处方及制备工艺</keyword><keyword>质量研究</keyword><keyword>稳定性</keyword></keywords><dates><year>2015</year></dates><publisher>中国人民解放军军事医学科学院</publisher><work-type>硕士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[9]，测定其吸光度（A），结果见表10，0、2、4、6、8、12小时的吸光度分别是0.552、0.548、0.555、0.556、0.563、0.576，6个时间点测定的吸光度的RSD为1.78%，小于2.0%；结果符合规定。该结果表明硫唑嘌呤片溶出液12小时内放置在室温下[7]，不会发生明显变化，性质稳定。表10溶液稳定性结果（n=6）时间（h）吸光度（A）RSD（%）00.5521.7820.54840.55560.55680.563120.576（5）重复性试验取30min溶出液6份，每份10ml，分别过滤后得到供试品溶液，于280nm波长处,，测定其吸光度（A），计算其溶出度，结果见表11，结果显示本品6份样品的平均溶出为89.63%，RSD为1.71%，故经分析，结果表明本法具有较好的重复性。表11重复性试验结果（n=6）试验123456平均RSD溶出（%）87.0389.8889.0190.4289.8491.5989.631.71（6）仪器精密度试验取浓度为10ug/ml的硫唑嘌呤溶液，连续测定7次，将测得其的吸光度（A）记录如表12。结果显示7次硫唑嘌呤溶液间的吸光度RSD为0.314%，小于2.0%，故经分析，结果表明仪器具有良好的精密度，结果波动幅度不大。表12仪器精密度试验结果（n=7）试验1234567均值RSD(%)吸光度A0.6210.6200.6220.6210.6190.6250.6200.6210.314（7）滤膜吸附试验表13滤膜吸附试验结果（n=6）处理方法吸光度RSD（%）0.22um滤膜过滤0.6818.600.45um滤膜过滤0.6970.8um滤膜过滤0.796结果见表13，三种过滤方式所得溶出液的溶出度为0.681、0.679、0.796，故经分析得，3种方法吸光度差异较大，尤其是0.8um滤膜过滤与0.22um滤膜过滤和0.45um滤膜过滤差别较大，但0.22um滤膜过滤与0.45um滤膜过滤差别不大，综合考虑，为了节省处理样品的时间，我们采用0.45um滤膜处理样品ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王慧</Author><Year>2016</Year><RecNum>60</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[10]</style></DisplayText><record><rec-number>60</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684172219">60</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>王慧</author></authors><tertiary-authors><author>陶春蕾,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>阿戈美拉汀舌下片的处方工艺及其在比格犬体内的药代动力学研究</title></titles><keywords><keyword>阿戈美拉汀</keyword><keyword>舌下片</keyword><keyword>生物利用度</keyword><keyword>个体差异</keyword><keyword>药代动力学参数</keyword></keywords><dates><year>2016</year></dates><publisher>安徽中医药大学</publisher><work-type>硕士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[10]。3.2.2溶出曲线测定方法随机选取体积和质量相近的硫唑嘌呤片6片，称重，记录6片样品的片重。照《中国药典》2020版硫唑嘌呤片溶出度的测定方法，使用桨法，转速为50r/min，需待溶出仪水箱中水的温度达到37℃时，才开始往溶出杯中投药，在片剂溶出的过程中要注意观察硫唑嘌呤片的体外溶出行为，记录其体外体外溶出行为，必要时可以拍照记录。结果如表14所示，观察数据可得，参比制剂在四种溶出介质中5min内溶出均能到达30%左右，说明硫唑嘌呤片在胃肠环境中溶出速度快，吸收良好。根据《中国药典》二部记载，对硫唑嘌呤片体外释放的标准为在水中30min内应能达到75%，参比制剂不仅达到了国内的标准，而且远超该标准，在四种介质中30min均能达到75%，且几乎30min内溶出均能达到80%，更有甚者达到85%，可见参比制剂在体外释放方面比国产硫唑嘌呤片优秀。表14硫唑嘌呤片参比制剂在四种介质中的溶出度（n=24）溶出介质编号5min溶出度（%）10min溶出度（%）15min溶出度（%）30min溶出度（%）45min溶出度（%）60min溶出度（%）Ph1.2盐酸溶液134.7770.0888.8189.191.5994.08243.2573.3175.7976.0987.296.71334.0767.681.7982.5283.1189.67439.3959.8580.9181.0584.4284.72542.8480.9186.6288.0891.1597.17635.9977.9981.0581.6486.3988.01平均值38.3972.8283.2885.6985.9787.49水144.7171.9977.9986.0391.1592.32240.5677.9982.8185.7489.8890.13326.5161.0274.0384.8685.0189.10427.8664.2376.2389.9890.4297.00524.5263.577.887.6489.8489.84618.6265.3182.7689.5491.5993.64平均值30.4667.3478.687.1389.9390.22Ph4.0醋酸盐溶液129.3161.9179.0494.1495.4596.71233.3069.6484.4890.9992.5895.61326.1860.6972.1078.5688.5489.15424.5169.6475.7987.3592.2794.02525.9955.8978.6891.6593.07102.77633.7568.3781.6088.9791.8295.54平均值28.8456.5978.6289.5491.7595.24Ph6.5磷酸盐溶液126.2959.6268.5691.9393.2895.01220.2554.8171.9888.0093.4994.25328.6361.7078.4685.2491.7692.12432.1764.4271.6376.8385.56106.02523.2355.3875.1482.0488.1395.25628.7456.9371.9185.9887.0195.01平均值26.5560.371.4685.5289.7791.62图4参比制剂硫唑嘌呤片在四种不同介质中的溶出曲线（n=24）3.3含量测定3.3.1方法来源照Chp（2020年版二部）硫唑嘌呤片的含量测定方法，其使用的是高效液相色谱法，色谱条件见表15。表15色谱条件色谱条件填充剂十八烷基硅烷键合硅胶流动相甲醇-0.05%醋酸钠溶液（18∶82）柱温35℃检测波长300nm流速1ml·min-1进样体积10ul3.3.2方法学考察（1）色谱条件及系统适用性系统适应性试验是使用规定的对照品溶液或系统适用性溶液，在选定的色谱条件下进样试验，得到色谱图。系统适应性试验的考察项目有分离度（R）、理论板数（n）、拖尾因子（T）以及灵敏度ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>楼美娟</Author><Year>2021</Year><RecNum>81</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>81</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzewxtws5x0zr0essv7xvs925e9zsf055twz"timestamp="1684403105">81</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>楼美娟</author><author>蒋英华</author><author>羊洁芳</author><author>许菲菲</author></authors></contributors><auth-address>义乌海关;</auth-address><titles><title>气相色谱单点法检测消毒湿巾中的乙醇</title><secondary-title>化学分析计量</secondary-title></titles><periodical><full-title>化学分析计量</full-title></periodical><pages>59-62</pages><volume>30</volume><number>08</number><keywords><keyword>气相色谱法</keyword><keyword>单点法</keyword><keyword>消毒湿巾</keyword><keyword>乙醇</keyword></keywords><dates><year>2021</year></dates><isbn>1008-6145</isbn><call-num>37-1315/O6</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[11]，从色谱图中得到以上参数，与Chp所载的标准进行对比，若符合要求，则认为该色谱系统适用于供试品的检测；如若不符合要求，必要时，可对色谱条件进行适当的调整。按照Chp2020年版二部记载的系统适应性溶液的配置方法，配制系统适应性溶液，平行配制6份，分别进样20ul，记录色谱图中硫唑嘌呤所示峰的保留时间和峰面积（A），计算理论塔板数和拖尾因子，考察理论塔板数（n）和拖尾因子（T）是否符合规定。结果如表16所示，6份供试品溶液保留时间的RSD和峰面积的RSD均小于2.0%，理论塔板数（n）均大于3000，拖尾因子（T）均符合规定，表明《中国药典》所载含量测定方法的系统适应性良好。表16系统适用性试验结果（n=6）名称保留时间峰面积理论塔板数拖尾因子112.390484886732.5861.302319212.369474767053.4771.286482312.369469587053.4771.289061412.369481036841.0131.326772512.373475817364.0881.283207612.372479267295.5581.282869RSD（%）0.061.12（2）专属性取空白辅料、硫唑嘌呤对照品、原料药分别制成待测样品，每个样品精密取样20ul，注入液相色谱仪，以检测其专属性是否符合规定。结果如图5-8所示，硫唑嘌呤在13min左右出锋，且在该位置没有溶剂峰和辅料的干扰峰，说明本法具有较好的专属性。图5空白辅料色谱图图6空白溶剂色谱图图7对照品溶液色谱图图8供试品溶液色谱图（3）线性与范围配制三个浓度水平的供试品溶液，过滤，注入高效液相色谱仪，用紫外检测器进行检测，得到色谱图，读取峰面积（A）。结果如表17所示，经线性拟合得线性回归方程为Y=27200x-13296，相关系数r2为0.9987，相关系数开方后为0.99934。结果表明，在硫唑嘌呤浓度为2.5ug/ml~5ug/ml内，峰面积（A）与浓度呈良好的线性关系。表17含量测定中线性关系考察结果（n=6）浓度C（ug/ml）2.53.03.544.55峰面积（A）54004695608085096416108897122487线性回归方程Y=27200x-13296相关系数R=0.9987图9含量测定中线性关系考察结果（n=6）（4）回收率称取同一批号硫唑嘌呤片样品6份，每份0.01g，采用加样回收法测定。分别加入本底量为80%~120%样品的硫唑嘌呤对照品，将0.01g的片粉与加入量的对照品置于100ml容量瓶中，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，加流动相（甲醇：0.05%醋酸钠溶液=18:82）稀释至100ml，从中取出约10ml，滤过。取1ml滤液放入10ml量瓶中，加水稀释到10ml，充分震荡。结果如表18所示，三个浓度水平的平均值的RSD为0.23%，小于2.0%，结果表示表示本法具有较好的准确度。表18回收率实验结果（n=9）浓度对照品加入量（w/mg）样品量（w/mg）测得量（w/mg）回收率（%）平均（%）RSD（%）80%2.5403.1755.60898.1399.380.232.5403.1755.71199.932.5403.1755.720100.09100%3.1753.1756.25198.4499.843.1753.1756.450101.573.1753.1756.31899.50120%3.813.1756.988100.0499.613.813.1756.89498.703.813.1756.992100.10（5）仪器精密度取线性③溶液（浓度为3.5ug/ml）10ul，连续测定6次，将测得其的吸光度（A）记录如表5。结果如表19所示，6次硫唑嘌呤溶液间的吸光度RSD为0.314%，小于2.0%，故经分析，结果表明仪器具有良好的精密度，结果波动幅度不大。表19仪器精密度试验结果（n=6）试验123456峰面积（A）850208598186065862038653986859RSD（%）0.727（6）溶液稳定性取供试品溶液，使供试品溶液在12小时内放置在室温下，分别于0h、2h、4h、6h、8h和12h取样，测定其吸光度，结果如表20所示，6个取样点所得的峰面积的RSD为1.68%，小于2.0%；结果符合规定，表明供试品溶液12小时内放置在室温下，不会发生明显变化，性质稳定。表20溶液稳定性结果（n=6）时间（h）峰面积（A）RSD（%）0555421.682548744534266531478546781254723（7）耐用性试验耐用性是指在色谱测定条件有微小变动时，所测得结果不受外界影响的承受程度[11]，对能影响本品检测的色谱条件进行微调，通过适当改变流速、波长、柱温、流动相等条件，考察峰面积计算出含量(Chp规定为硫唑嘌呤片中应含有硫唑嘌呤为标示量的93%~107%)，计算在各个色谱条件下测定的含量的相对偏差，结果如表21所示，8种不同的色谱条件下所测的的含量的RSD为1.69%，小于2.0%，符合验证要求。结果表明，色谱条件发生轻微变动时，检测方法的检测结果也会有些许变动，但是变动情况仍然在可接受的情况下。表21耐用性试验结果（n=8）色谱条件含量（%）平均含量RSD（%）正常条件101.2100.061.69流速0.8ml/ml97.4波长298nm99.9波长302nm98.4柱温33℃100.1柱温37℃99.5有机相+2%102.7有机相-2%101.34总结展望4.1全文总结硫唑嘌呤片是治疗急性风湿性关