蛋白质分离纯化与表征

关于蛋白质分离纯化与表征蛋白质分离纯化是利用其特性的差异分子的大小和形状酸碱性质溶解度吸附性质对配体分子的特异生物学亲和力蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，制订分离纯化的合理程序。第2页,共43页，2024年2月25日，星期天

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性

碱/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白质的酸碱性质第3页,共43页，2024年2月25日，星期天

蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间

1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白质分子的大小与形状第4页,共43页，2024年2月25日，星期天测定蛋白质相对分子质量的原理和方法（一）根据化学组成测定最低相对分子质量（二）渗透压法测定相对分子质量（三）蛋白质的扩散和扩散系数（四）沉降分析法测定相对分子质量（五）凝胶过滤法测定相对分子质量（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量第5页,共43页，2024年2月25日，星期天（一）根据化学组成测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量2、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量=100*55.8/铁的百分含量例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对分子质量就是55.8/0.335×100=16700第6页,共43页，2024年2月25日，星期天（五）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不取决于分子的质量，而是它的斯托克半价。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同，则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克半径第7页,共43页，2024年2月25日，星期天蛋白质混合样

标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形）第8页,共43页，2024年2月25日，星期天（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状但是如果在该系统中添加SDS和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。第9页,共43页，2024年2月25日，星期天第10页,共43页，2024年2月25日，星期天十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键第11页,共43页，2024年2月25日，星期天第12页,共43页，2024年2月25日，星期天第13页,共43页，2024年2月25日，星期天第14页,共43页，2024年2月25日，星期天蛋白质分子的形状蛋白质分子在溶液中的形状或构象的信息，可借助其摩擦系数与理想球体的摩擦系数之比，也就是所谓的蛋白质分子的摩擦比来推测。摩擦比越大，蛋白质分子的不对称性越高。第15页,共43页，2024年2月25日，星期天三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液第16页,共43页，2024年2月25日，星期天蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性3.质点的大小（1～100nm）蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质第17页,共43页，2024年2月25日，星期天（二）蛋白质的沉淀

Pr从胶体溶液中析出任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀I可逆沉淀温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解

——非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等第18页,共43页，2024年2月25日，星期天

不可逆沉淀强烈沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解——变性沉淀如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等Ⅱ第19页,共43页，2024年2月25日，星期天1.盐析法加入大量中性盐（硫酸铵、硫酸钠和氯化钠）脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性第20页,共43页，2024年2月25日，星期天等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶第21页,共43页，2024年2月25日，星期天盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（（NH4）2SO4）第22页,共43页，2024年2月25日，星期天2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用3.等电点沉淀蛋白质分子带有相同数量的正负电荷，因此，蛋白质分子相互吸引，从而聚集沉淀。第23页,共43页，2024年2月25日，星期天4.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态第24页,共43页，2024年2月25日，星期天四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶是最后步骤第25页,共43页，2024年2月25日，星期天五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法

1、透析和超过滤利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料第26页,共43页，2024年2月25日，星期天血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液第27页,共43页，2024年2月25日，星期天2、密度梯度（区带）离心用一定的介质（如蔗糖）在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将蛋白质混合液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使蛋白质分层、分离。第28页,共43页，2024年2月25日，星期天3、凝胶过滤3.凝胶过滤第29页,共43页，2024年2月25日，星期天（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀

调整溶液pH

不同蛋白在各自

pI处依次沉淀

2.盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离法降低介电常数争夺水化膜影响溶解度的外部因素有：pH值、离子强度、介电常数和温度。4.温度对蛋白质溶剂度的影响第30页,共43页，2024年2月25日，星期天（三)根据电荷不同的分离方法1.电泳原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同第31页,共43页，2024年2月25日，星期天平板电泳第32页,共43页，2024年2月25日，星期天等电聚焦电泳第33页,共43页，2024年2月25日，星期天双向电泳第34页,共43页，2024年2月25日，星期天离子交换层析第35页,共43页，2024年2月25日，星期天（四）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析疏水作用层析第36页,共43页，2024年2月25日，星期天（五）利用对配体的特异生物学

亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒具有极强的专一性第37页,共43页，2024年2月25日，星期天第38页,共43页，2024年2月25日，星期天（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析，离子交换层析，吸附层析以及凝胶过滤。第39页,共43页，2024年2月25日，星期天六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（一）蛋白质含量测定常用方法：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法、染料结合法（bradford或考马斯亮蓝法）和胶体金测定法。Lowry法，主要是利用folin-酚试剂能与Cu+离子反应，而Cu+是由蛋白质的巯基或酚基氧化Cu2+而产生双缩脲反应：含两个或两个以上的肽键化合物与CuSO4溶液都能发生双缩脲反应省市紫红色或蓝紫色复合物。第40页,共43页，2024年2月25日，星期天（二）蛋白质纯度鉴定通常采用电泳、沉降、HPLC和溶解度分析。第41页,共43页，2024年2月25日，星期天凝胶过滤和SDS均是利用凝胶，按照分子大小分离蛋白质的，为什么凝胶过滤时，蛋白质分子越小，洗脱速度越慢，而在SDS中，蛋白质分子越小，迁移速度越快凝胶过滤时，凝胶颗粒排阻Mr较大的蛋白质，仅允许Mr较小的蛋白质进入颗粒内部，所以Mr较