G试验-侵袭性真菌病的辅助诊断方法

湛江安度斯生物有限公司1唐丽娟:内容目录一、真菌感染概一、真菌感染概述二、真菌与葡聚糖三、鲎试验与G试验四、G试验——临床意义五、“生物探针”介绍六、“生物探针”操作流程七、“生物探针”的临床比对八、G试验的影响因素湛江安度斯生物有限公司是查尔斯河公司设在中国的子公司，是中国细菌内毒素检测试剂的最大供应商，也是中国细菌内毒素检测领域的技术领导者和创新先锋；世界著名的美洲鲎试剂（LAL）生产企业——美国CR恩度斯弗公司（CharlesRiverEndosafe,Inc.），也是查尔斯河实验室公司的子公司湛江安度斯的简介CharlesRiverLaboratories作为全球最大的实验动物公司，CharlesRiverLaboratories一直是全球实验动物商业化繁育和市场供应的领导者，拥有分布在北美、欧洲和日本的15个分设施和遍布全球的销售网络；已成为一个生物医学前临床产品和服务的主要供应商。库珀博士CREndosafe（恩度斯弗）公司是美国著名三大鲎试剂企业之一,有国际知名权威学者詹母斯弗.库珀博士(Dr.JammesF.Cooper)创建。库珀博士是细菌内毒素检查研究领域的先驱。1971年他与Lein及Banger等人提出以鲎实验法检查热源，并率先证明了鲎实验法作为注射药品热源检查的敏感方法的价值。1972年他协助美国(TheparentralDrugAssociation)的鲎试剂.他一直主持着美国非经肠道药物协会(TheparenteralDrugAssociatoin)的鲎实验应用促进工作,以及每年一届的美国南卡罗纳州查尔顿的鲎实验学术会议。库珀博士创建的Endosafe公司现以成为美国鲎试剂(LAL)市场最大的供应商.该公司的鲎试剂以其良好的稳定性,广泛的适用性以及优越的抗干扰性能享誉国际医药工业界.一、真菌感染概述真菌感染：真菌感染在通常情况下我们最常见的是表皮的感染，例如头癣、体癣、甲癣等，由于侵犯的部位大都表浅，不会导致严重问题，因而叫浅部真菌感染；深部真菌感染则是真菌突破人体天然屏障导致组织脏器的感染。7美国死于感染性疾病的十大原因820围产期828真菌101053胃肠道1305围产期91259结核1277肝胆管82370真菌1377胃肠道74596肝胆管1402细菌性脑膜炎65577心脏2333肺结核513,413肾脏/泌尿道2486心脏416,524HIV/AIDS8006肾脏/泌尿道322,396败血症9438败血症287,181呼吸道56,966呼吸道1死亡人数感染类型死亡人数感染类型19971980真菌感染的死亡率上升了3.4倍（死亡率：0.7~2.4/100,000）8EORTC/MSG原称侵袭性真菌感染（IFI），修订后改称IFD；是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的疾病。是真菌感染致死的重要原因侵袭性真菌病(InvasiveFungalDisease,IFD)9侵袭性真菌病已变得越来越常见10侵袭性真菌感染的诊断标准G试验可作为拟诊病例的微生物学标志11主要可引发侵袭性真菌病的疾病肿瘤类：胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤12二、真菌与葡聚糖2024/4/12131.某些真菌的细胞壁结构2.细胞壁含有葡聚糖组分的真菌：

（1）是导致侵袭性真菌病(IFD)的常见真菌。

（2）细胞壁有葡聚糖组分2024/4/1214这类真菌有：

念珠菌

曲霉菌

耶氏肺孢菌

镰刀酶

隐球菌接合菌.......2024/4/1215北京301医院尸检结果（77～97年）肺真菌病发生率3.7％(38/1027)隐球菌病、接合菌病占真菌病比例不高16当人体深部受这类真菌感染时，真菌在代谢过程会不断释放出葡聚糖。检查患者的血液（血浆或血清），会发现葡聚糖含量明显高于非感染者。因此，葡聚糖可作为具有这种细胞结构的真菌感染标识物。2024/4/1217三、鲎试验与G试验1.鲎（Hòu，后）试验2024/4/1218

鲎是地球上最古老的海洋生物之一，已有三亿多年的历史，人们称它为“活化石”。雌雄2024/4/1219研究发现，鲎的循环细胞（阿米巴细胞）中含有一种特殊的凝固酶原。这种凝固酶原可以被自然界广泛存在的两种物质激活为凝固酶，从而导致一系列的生化反应。这两种物质就是脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和(1-3)--D葡聚糖。2024/4/1220

人们利用鲎的阿米巴细胞溶胞物制备成了鲎试剂（LAL或TAL）。通常称使用鲎试剂检测脂多糖（LPS）或

-葡聚糖（-G）的试验为鲎试验（LALTestorTAL

Test）。2024/4/12212.鲎试验反应机理223.鲎试验的应用应用I：细菌内毒素检查(BacterialEndotoxinTest,BET)2024/4/1223研究发现，革兰氏阴性细菌的细胞壁都含有一种叫内毒素(Endotoxin)的组分。2024/4/1224

内毒素是能够引起哺乳动物原反应的主要热原物质。革兰氏阴性细菌在新陈代谢过程不断地向环境释放内毒素，污染药品和医疗器械。因此注射药品和医疗器械都要求必须作细菌内毒素检查（BET）。2024/4/1225应用II：

革兰氏阴性菌脂多糖检测2024/4/1226细菌内毒素的化学成分是脂多糖。当人体深部感染革兰氏阴性菌时，细菌会在体内不断释放内毒素（脂多糖）。检查患者的血液（血浆）、腹水、尿液及脑脊液，会发现脂多糖明显高于非感染者。脂多糖检测对败血症、严重器官衰竭的快速辅助诊断有临床价值。2024/4/1227应用III：

真菌(1-3)--D葡聚糖检测2024/4/1228

医学上通常把用于检测真菌葡聚糖的鲎试验称为G试验。这是取葡聚糖的英文名称Glucan的首字母来命名该试验。2024/4/1229需要指出的是，隐球菌的细胞壁虽然有葡聚糖组分，在隐球菌感染患者的血液中却检测不出葡聚糖异常。这可能与隐球菌具有特殊的细胞被膜有关。因此G试验不适合对隐球菌感染的检测。2024/4/1230四、G试验——临床意义31G试验的临床意义32G试验的临床意义333435G试验应用科室36五、“生物探针”介绍37“生物探针”介绍38“生物探针”介绍39“生物探针”介绍40“生物探针”介绍41“生物探针”功能快速定量的临床检测方法，帮助临床医生早期诊断目前常规方法难以判断的侵袭性真菌感染、革兰氏阴性菌感染，便于对感染的早期诊断、早期治疗及对治疗的疗效判定。可检测标本：血浆、血清、尿液、腹水、脑脊液等42六、“生物探针”操作流程43“生物探针”操作流程44“生物探针”操作流程45“生物探针”操作流程46“生物探针”操作流程47“生物探针”操作流程48“生物探针”操作流程49“生物探针”操作流程50“生物探针”操作流程数据可接入LIS系统等51侵袭性真菌感染的临床检测方法对比52产品特点灵敏度高快速检测方法严谨准确性高特异性好临床符合率高53七、“生物探针”的临床比对J厂家的

-G试剂、LPS试剂均无特异性54最低检测限最低浓度重复性厂商 安度斯 最低检测限 10pg/ml编号 检测结果(pg/ml) 阴性(pg/ml)

检测日期1 10.3

<1.3

3.62 10.1

3 11.0 4 9.8 5 9.8 6 10.8 7 10.1 8 10.0 9 9.6 10 10.3

CV=6.85%11 10.0 12 9.8 13 10.7 14 9.8 15 12.4 16 10.3 17 9.7 18 9.6 19 9.4 20 9.9 21 9.6 批内精密度批间精密度“生物探针”的临床比对评价结论：安度斯产品的综合性能具有明显优势。58八、G试验的影响因素2024/4/12591.检测试剂的灵敏度1.1葡聚糖的量值与标准品2024/4/12602024/4/1261

目前G试验中葡聚糖采用的单位为重量单位“pg”。pg是一个非常非常微量的单位。因此G试验是一项非常灵敏的生物检测。当然，越是灵敏精确的检测，越容易受到干扰。目前葡聚糖没有公认的标准物质！没有国际标准品，没有国家标准品，也没有公认的行业标准品，只有企业的标准品（质控品）2024/4/1262各企业的葡聚糖标准品的来源不一。有的来自茯苓多糖，有的来自香菇多糖，有的来自海藻多糖。不同来源的葡聚糖对鲎试剂的活性不同。各企业的葡聚糖标准品效价不一。你的1pg可能相当我的10pg。相互之间无可比性。2024/4/1263无统一的标准品导致不同厂家试剂盒有不同的参考值。有的是10pg为阳性，有的是100pg为阳性。对参考值的表示各厂家也有所不同。有的以全血含量来表示，有的以检测浓度来表示。2024/4/12641.2试验器具对G试验有重要的影响！葡聚糖是自然界广泛存在的一种物质，极容易污染到试验器具。葡聚糖是一种非常稳定的物质，通常的蒸煮高压、辐照等灭菌手段不能彻底破坏葡聚糖。很难找到真正意义的无葡聚糖的器具。2024/4/1265G试验使用到的实验器具：采血针采血管（瓶）反应试管移液器具（吸头）最主要的污染来自采血管！2024/4/1266重要建议最好使用厂家供应的专用采血管（瓶）其次是用经厂家检测合格的采血管不能使用未经检测的实验器具2024/4/1267尊重科学，为患者负责！无效试验是对患者最大的危害！2024/4/12682.试剂的生物特异性

如前所述，G试验的检测试验就是鲎试剂。鲎试剂可以对两种物质反应，用于不同的用途。如下图表示。

检测内毒素/脂多糖用于革兰氏阴性菌检测

鲎试剂

检测葡聚糖（G试验）用于真菌检测2024/4/1269在检测试剂制备上，应根据试剂的用途制备生物特异性强的检测试剂，如：用于检测细菌脂多糖的试剂，不能对葡聚糖产生反应。用于检测真菌葡聚糖的试剂，不能对脂多糖产生反应。2024/4/1270

遗憾的是，由于技术的原因，并不是所有厂家的试剂都具有生物特异性。有的试剂盒对LPS和-G都反应。有的试剂盒对非检测对象低浓度时可能不反应，较高浓度时会反应。无生物特异性的试剂盒不能区分细菌感染和真菌感染，不具有临床检测价值！2024/4/12712024/4/1272

鉴别试剂盒是否具有生物特异性的方法：用该试剂盒与LPS/-G的标准品（质控品）反应。3.某些药物对G试验的影响3.1临床应用发现，注射过香菇多糖注射液的供试者作G试验，其血液中葡聚糖含量会显著增高。因此需要作G试验的供试者应在24小时内避免使用香菇多糖注射液。2024/4/12733.2临床应用发现，使用过脂肪乳的供试者作G试验（包括作LPS检测），反应曲线形态会发生异常，致使检测值非常高。因此需要作G试验的供试者应在24小时内避免使用脂肪