生物大分子的分离纯化技术省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

生物大分子分离纯化技术生物样品特点:生物活性复杂性内容:生物样品常规分离纯化方法临床及生化分析样品预处理生物大分子电泳分离纯化技术生物大分子色谱分离纯化技术1/35生物样品常规分离纯化方法透析微过滤盐析冷冻干燥离心2/35透析基本原理透析膜:

材料:火棉胶(Collodion),玻璃纸(Cellophane),纤维素(Cellulose)纤维透析管处理:1%乙酸水溶液1h,碱性EDTA(1%Na2CO3,1mMEDTA)煮1h,纯水清洗,保留.透析液:水,缓冲液,高分子浓溶液Donnan效应:pH改变

(勤换透析液,使用大量透析液)3/35Donnan效应:4/35微过滤类型:深层滤器(DepthFilter):滤膜滤器(ScreenFilter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)微过滤技术应用:溶液澄清微量沉淀物搜集细菌细胞搜集微过滤5/35盐析基本原理：

在盐浓度很低时，蛋白质溶解度随盐浓度升高而增加，这称为盐溶；随盐浓度不停增加，蛋白质溶解度不停降低而沉淀析出，即盐析。盐析试验应注意问题：

盐类选择：硫酸铵（767g/l,25℃)盐饱和度：温度：室温或4℃pH：等电点蛋白质浓度：6/35冷冻干燥基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下进行干燥方法。冷冻干燥条件：温度，-10~-40℃；真空度，13~40Pa。7/35离心基本原理种类：普通离心机（6000rpm)，高速离心机(25000rpm)，超速离心机转子：固定角度式，悬挂吊桶式8/35离心(2)离心力和相对离心力(Relativecentrifugalforce)：F=mω2r;Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r沉淀速度与沉降系数：F摩擦=fvF净=(Mp-Ms)ω2r-fv沉降系数：沉淀速度与离心力比率（单位离心场中颗粒沉降速度），蛋白质\核酸\病毒等沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒范围.

以1×10-13s为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.

9/35离心(3)离心技术类型：

最大速度方法：

移动界面（MovingBoundary)超速离心法移动区带(MovingZone)超速离心法

等密度方法(Iso-density)：10/35临床及生化分析样品预处理

样品类型、采集与保留酶样品准备11/35样品类型、采集与保留样品类型：12/35样品类型、采集与保留样品采集血样：

全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml)血浆：g离心10min血细胞：血清：5~30min自凝分离

尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH<2.5)，碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）

唾液：

组织样品：液氮等冷冻13/35酶样品准备酶活性保持控制纯化过程中pH、温度及有机试剂加入载体蛋白预防酶吸附，如:BSA加入辅助因子保护活性部位,如:EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽抑制蛋白酶水解作用，如:氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）酰-亮-亮-精三肽等亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等样品制备从组织或器官制备样品从组织或器官培养液中制备样品从生物体液中制备样品（5000rpm,15min)从细胞培养液制备样品14/35电泳分离纯化技术聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳高效毛细管电泳15/35电泳分离纯化技术基本原理

V=μeE(μe为电泳迁移率,即电场强度为1V/cm时迁移速率.)影响电泳分离原因:

物质本身结构和性质:

荷电性质,形状

支持介质:吸附作用,电渗作用溶液介质:pH,离子强度电场强度:

常压

500V16/35聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶结构和性质

凝胶机械强度、弹性、透明度和黏度等取决于凝胶总浓度:17/35聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)凝胶电泳装置柱型(ColumnGel):10cm×6cm板型(SlabGel):12cm×12cm或14cm×16cm;玻璃板间距1.75或1.5cm.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(盘状电泳)电荷效应浓缩效应分子筛效应18/35不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳19/35聚丙烯酰胺凝胶电泳应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

1%SDS+0.1M巯基乙醇分子量1.0×104~2.0×105蛋白质等电聚焦(IsoelectricFocusing,IEF)

原理pH梯度形成与保持

20/35琼脂糖凝胶电泳特点：适合分子量大分子；无毒；分辨率高；重复性好

胶浓度：0.5%~3%；分离1~9.0×107DNA片段0.5~1.0%胶分离0.5~30kbDNA,1.0~1.5%胶分离小片段21/35琼脂糖凝胶电泳应用限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段分析DNA超螺旋结构判定DNA分子量测定脉冲场凝胶电泳22/35DNA分子量测定23/35高效毛细管电泳仪器24/35毛细管:I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm;L,0.1~1m进样系统:nL~pL,流体力学方法和电动进样高压直流电源：30kV,1~300μA

检测

紫外-可见吸收法荧光检测法电化学检测法质谱法25/35高效毛细管电泳基本概念：电泳淌度电渗流分析参数：淌度和迁移时间分离效率分离度26/35高效毛细管电泳分离模式毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)毛细管胶束电泳（CapillaryMicellarElectrokineticChromatography,CEKC)毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis,CGE)毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF)27/35CGE应用DNA序列分析蛋白质分析物理胶CZE28/3529/3530/35生物大分子色谱分离纯化技术排阻色谱亲和色谱离子交换色谱反相及疏水作用色谱液－液分配色谱31/3532/35亲和色谱固定相

葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺－琼脂糖混合凝胶，（与凝胶色谱相同）

配