生化物质的测定方法

关于生化物质的测定方法第二部分生化实验技术

PART2BIOCHEMICALEXPERIMENTALTECHNIQUE生化物质的分析检测方法生化物质的制备和分离纯化蛋白质的分子结构与性质研究免疫学方法在生化实验中的应用第2页,共66页，2024年2月25日，星期天第七章生化物质的分析检测方法滴定分析法光谱学方法放射性同位素方法一些特定生化物质的分析检测第3页,共66页，2024年2月25日，星期天7-1滴定分析法适合滴定分析的条件常用的滴定方法注意事项第4页,共66页，2024年2月25日，星期天适合滴定分析的条件反应有严格的化学计量关系反应能够迅速完成有合适方法确定滴定终点第5页,共66页，2024年2月25日，星期天常用的滴定方法酸碱滴定直接滴定、间接滴定氧化还原滴定重铬酸钾法、高锰酸钾法、碘量法沉淀滴定配位滴定第6页,共66页，2024年2月25日，星期天注意事项标准溶液与基准物质反应条件的控制反应的适用范围滴定终点的判断反应干扰因素的消除结果的正确计算第7页,共66页，2024年2月25日，星期天7-2光谱学方法电磁辐射与光谱光吸收的定量紫外与可见光光谱法荧光光度法红外光谱法核磁共振法第8页,共66页，2024年2月25日，星期天电磁辐射与光谱光属于电磁波自然界中存在各种不同波长的电磁波分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ=1,000nm）之间200nm－400nm为紫外光区400nm－760nm为可见光区760nm－10,000nm为红外光区第9页,共66页，2024年2月25日，星期天光吸收的定量Lambert-Beer’sLaw-lgT=A=D=aCLT：transmittance；A：absorbance；D：opticaldensitya：absorbancecoefficient（摩尔吸光系数/百分吸光系数）L：distance/thickness第10页,共66页，2024年2月25日，星期天分光光度计基本结构简介分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统

第11页,共66页，2024年2月25日，星期天光源钨灯和卤钨灯发射320－2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。红外线光源则由纳恩斯特（Nernst）棒产生，此棒由ＺrＯ2:Ｙ2Ｏ3=17:3（Ｚr为锆，Ｙ为钇）或Ｙ2Ｏ3，ＧeＯ2（Ｇe为铈）及ＴhＯ2

（Ｔh为钍）之混合物制成。第12页,共66页，2024年2月25日，星期天分光系统（单色器）与狭缝单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。

狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。第13页,共66页，2024年2月25日，星期天比色环比色环也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。第14页,共66页，2024年2月25日，星期天检测器系统检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等。第15页,共66页，2024年2月25日，星期天紫外与可见光光谱法定量方法：吸光系数法、标准曲线法、对照法注意事项：选择合适的仪器和比色皿尽可能在吸光度0.1~1.0的范围内测定选择合适的灵敏度尽可能做吸收光谱做空白与对照实验第16页,共66页，2024年2月25日，星期天荧光光度法激发光/发射光（荧光fluorescence）定量方法：直接测定法：标准曲线法、对照法间接测定法：化学转化法、荧光瘁灭法、敏化发光法第17页,共66页，2024年2月25日，星期天注意事项：选择合适的仪器和比色皿控制好测定的溶剂、浓度、酸度、温度、时间，并尽量消除干扰因素选择合适的激发波长和发射波长做空白与对照实验荧光光度法比紫外可见光度法灵敏1000~10000倍第18页,共66页，2024年2月25日，星期天红外光谱法、核磁共振法主要进行物质结构和成分的分析第19页,共66页，2024年2月25日，星期天分光光度技术的基本应用测定溶液中物质的含量用紫外光谱等鉴定化合物第20页,共66页，2024年2月25日，星期天用紫外光谱鉴定化合物使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。第21页,共66页，2024年2月25日，星期天当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线开关一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。第22页,共66页，2024年2月25日，星期天7-3放射性同位素方法-、-、-、x--：3H、14C、32P、35S、131I-：235U、238U、-：

60Co液体闪烁计数器法放射自显影法第23页,共66页，2024年2月25日，星期天同位素符号半衰期β射线能量（MeV）氢-33H12.3年0.018碳-1414C5720年0.156磷－3232P14.3天1.71硫－3535S87.1天0.167碘－131131I8.05天0.605常用同位素的特征

第24页,共66页，2024年2月25日，星期天各种射线的特点α射线通过物质时，主要是通过电离和激发把它的辐射能量转移给物质，其射程很短，一个1兆电子伏（1MeV）的α射线，在空气中的射程

约1.0<厘米，在铅金属中只有23微米（um），一张普通纸就能将α射线完全挡住，但α射线的能量能被组织和器官全部吸收。

第25页,共66页，2024年2月25日，星期天

β射线也能引起物质电离和激发，与α射线

的能量相同的β射线，在同一物质中的射程比α要长得多，如>1MeVrβ射线，在空气

中的射程是10米，高能量快速运动的β粒子，如磷－，能量为1.71MeV遇到物质，特别是突然被原子序数高的物质（如铅，原子序数为82）阻止后，运动方向会发生改变，产生轫致辐射。轫致辐射是一种连续的电磁辐射，它发生的几率与β射线的能量

和物质的原子序数成正比，因此在防护上采用低密度材料，以减少轫致辐射。β射线能被不太厚的铝层等吸收。

第26页,共66页，2024年2月25日，星期天γ射线的穿透力最强，射程最大，1MeV的r射线在空气中的射程约有米之远，r射线作用于物质可产生光电效应、康普顿效应和电子对效应，它不会被物质完全吸收，只会随着物质厚度的增加而逐渐减弱。

第27页,共66页，2024年2月25日，星期天放射性强度及其度量单位

。放射性同位素不断地衰变，它在单位时间内发生衰变的原子数目叫做放射性强度（radioactivity），放射性强度的常用单位是居里（curie），表示在1秒钟内发生3.7×1010次核衰变，符号为Ci。

1Ci=3.7×1010dps=2.22×1012dpm

1mCi=3.7×107dps=2.22×109dpm

1μCi=3.7×104dps=2.22×106dpm

第28页,共66页，2024年2月25日，星期天1977年国际放射防护委员会（ICRP）发表的第26号出版物中，根据国际辐射单位

与测量委员会（ICRU）的建议，对放射性强度等计算单位采用了国际单位制（SI），

我国于1986年正式执行。在SI中，放射性强度单位用贝柯勒尔（becquerel）表示，简称贝可，为1秒钟内发生一次核衰变，符号为Bq。1Bq=1dps=2.703×10-11Ci该单位在实

际应用中减少了换算步骤，方便了使用。第29页,共66页，2024年2月25日，星期天放射防护

就外照射而言，由于各种射线穿透能力不同，γ射线照射对机体的危害大于β射线，而β射线的危害性又大于α射线。受照射部位不同，受害程度出不同，对某种放射性同位素蓄积率高的组织或器官，必然受害严重。

第30页,共66页，2024年2月25日，星期天当放射性物质进入了体内，对机体造成内照射的情形下，α射线由于射程很短，其危害性大于β射线和γ射线的危害，而β射线的内照射危害又大于γ射线。放射防护的必要性在于保护操作者本人免受辐射损伤，防止了必要的射线照射，保护周围人群的健康和安全，做好放射性污物、污水的收集与处理，避免环境污染，保证实验能够正常进行，取得的结果可靠。

第31页,共66页，2024年2月25日，星期天放射防护的三原则

1.放射实践的正当化

在进行任何放射性工作时，都应当代价和利益的分析，要求任何放射实践，对人群和环境可能产生的危害比起个人和社会从中获得的利益来，应当是很小的，即效益明显大于付出的全部代价时，所进行的放射性工作就是正当的，是值得进行的。

第32页,共66页，2024年2月25日，星期天2.放射防护的最优化

使放射性和照射量在可以合理达到的尽可能低的水平，避免一些不必要的照射，要求对放射实践选择防护水平时，必须在由放射实践带来的利益与所付出和健康损害的代价之间权衡利蔽，以期用最小的代价获取最大的净利益。第33页,共66页，2024年2月25日，星期天个人剂量限制

在放射实践中，不产生过高的个体照射量，保证任何人的危险度不超过某一数值，即必须保证个人所受的放射性剂量不超过规定的相应限值。规定工作人员全身均匀照射的年剂量当量限制为50毫希沃特*（mSv），当长期持续受放射性照射时，公众中个人在一生中每年全身受照射的年剂量当量限值不应高于1mSv(0.1rem)，且以上这些限制不包括天然本底照射和医疗照射。

第34页,共66页，2024年2月25日，星期天同位素示踪法基本原理和特点

同位素示踪所利用的放射性核素（或稳定性核素）及它们的化合物，与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的，只是具有不同的核物理性质。因此，就可以用同位素作为一种标记，制成含有同位素的标记化合物（如标记食物，药物和代谢物质等）代替相应的非标记化合物。利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质，就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等

第35页,共66页，2024年2月25日，星期天1.灵敏度高

放射性示踪法可测到10-14－10-18克水平

2.方法简便

放射性测定不受其它非放射性物质的干扰，可以省略许多复杂的物质分离步骤

3.定位定量准确

4.符合生理条件

第36页,共66页，2024年2月25日，星期天放射性同位素测量方法的选择.

测量方法的选择取决于射线种类对于α射线通常可用硫化锌晶体、电离室、核乳胶等方法探测；对能量高的β射线可用云母窗计数管、塑料闪烁晶体及核乳胶测定，对于能量低的β射线可用液体闪烁计数器测量：对于γ射线则用G-M计数管，碘化钠（铊）闪烁晶体探测。目前大多数实验室主要采用晶体闪烁计数法和液体闪烁计数法两种测量方式

第37页,共66页，2024年2月25日，星期天7-4一些特定生化物质的分析检测

蛋白质的分析与检测方法凯氏(Kjedahl)定氮法FOLIN-酚法双缩脲法紫外分光光度法染料结合法水扬酸比色法其他折光法、旋光法、近红外法谱法。第38页,共66页，2024年2月25日，星期天凯氏(Kjedahl)定氮法

凯氏定氮法可用于所有样品中蛋白质含量测定，因样品中常含有核酸，生物碱，含N类脂、卟啉以及含N色素等非蛋白质的含N化合物，故结果称为粗蛋白含量。凯氏定N法：始于1833年，现有常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法、改良凯氏法。第39页,共66页，2024年2月25日，星期天原理：样品蛋白质含量=样品蛋白质系数*样品N含量样品与浓H2SO4和催化剂一同加热消化，使样品中的蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO2逸出，而样品的有机N转化为NH3与H2SO4结合为（NH4）S2O，然后加碱蒸馏，使NH3蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸滴定，根据标准酸消耗量可算出样品的N含量。第40页,共66页，2024年2月25日，星期天

样品消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4催化剂硫酸铜硫酸钾硒(NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O第41页,共66页，2024年2月25日，星期天蒸馏：消化完全样品+NaOH→碱性→加热蒸馏→NH3↑2NaOH+（NH4）2SO4=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

第42页,共66页，2024年2月25日，星期天吸收与滴定加热蒸馏收出NH3硼酸溶液吸收，吸收完全后，用标准HCl溶液滴定。2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H2O（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl=2NH4Cl+4H3BO4因为硼酸微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色的反应，但有吸收NH3的作用。第43页,共66页，2024年2月25日，星期天适用范围可适用于各类蛋白质的测定。第44页,共66页，2024年2月25日，星期天操作方法

（1）样品消化（2-3小时）样品的准确称取样品及有关试剂的加入加热温度的控制（防止暴沸现象）抽气设施的安装消化终点的判断消化不完全的处理第45页,共66页，2024年2月25日，星期天（2）做好蒸馏的准备工作凯氏定氮仪的安装吸收瓶的洗涤与检查（甲基红-溴甲酚绿：酒红色-蓝绿色（PH：5.1））凯氏定氮仪的洗涤与检查蒸馏操作练习（用0.1414%的硫酸铵）第46页,共66页，2024年2月25日，星期天（3）样品的蒸馏（4）吸收（2%硼酸）（5）滴定（0.01mol/L盐酸标准溶液）（甲基红-溴甲酚绿：酒红色-蓝绿色（PH：5.1））第47页,共66页，2024年2月25日，星期天说明①所用试剂应用无氨蒸馏水配制。②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附壁上造成沦不完全，损失N。③消化过程中应注意不时转动瓶凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在壁上残渣洗下，并促进消化完全。④样品中若含脂肪or糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，应小火加热，或加少量辛醇or液体石蜡or硅油消泡剂并注意控制热源强度。第48页,共66页，2024年2月25日，星期天⑤样品消化液不易澄清时，可加30%H2O22~3ml消化⑥一般消化至透明后，继续30ml,即可。但含特别难以氨化的氮化合物样品，如：赖氨酸，组氨酸、色氨酸、酪氨酸，需延长时间、有机物消化完全呈蓝色的浅绿色，但含Fe高时，呈较深绿色。

第49页,共66页，2024年2月25日，星期天⑦蒸馏前给水蒸汽发出器内装水至2/3容积处，甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml使其始终保持酸性，这样可以逸避免水中NH3被蒸发而影响结果。

⑧2%硼酸吸收液每次用量10ml，用前加入甲基红一溴甲酚绿混合指示剂2d。⑨蒸馏时，蒸气发生要均匀充足，蒸馏过程不得停火断汽，否则将发生倒吸。⑩加碱要足，操作要迅速，漏斗应采用水封，以免NH3由此逸出。

第50页,共66页，2024年2月25日，星期天（11）微量法适合于测定含N量为0.05-3.0mg。（12）消化时，若用水泵做抽气装置，一定要等凯氏瓶从排气管上取下后，才能关闭水源，否则会发生倒吸。（13）在使用凯氏定氮仪时，一定要小心，特别应注意各个自由夹的正确使用。（14）凯氏定氮法可用于所有样品中蛋白质含量测定，因样品中常含有核酸，生物碱，含N类脂、卟啉以及含N色素等非蛋白质的含N化合物，故结果称为粗蛋白含量。第51页,共66页，2024年2月25日，星期天

凯氏定N法具有，应用范围广，灵敏度高，回收率好等特点，但消化样品费时，操作产生大量大害气体，污染环境为满足工艺过程加快速控制分析，减少污染，简便省时，又创立快速测定蛋白质方法：第52页,共66页，2024年2月25日，星期天Folin试剂法（Lowry法）PRO+Cu++/OH-（磷钨酸+磷钼酸）兰色物质（500/700nm）第53页,共66页，2024年2月25日，星期天双缩脲法

原理第54页,共66页，2024年2月25日，星期天

双缩脲反应PRO+Cu++/OH-

紫红色物质(560nm）在一定条件下，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比NH2NHCOCONH2第55页,共66页，2024年2月25日，星期天特点及应用范围：本法灵敏度低，但操作简单快速，常用于生化领域。本法亦适用于豆类，油料，米谷、等作物种子及肉类样品和乳制品第56页,共66页，2024年2月25日，星期天操作方法①标准曲线的绘制：以采用凯氏定N法测出pro含量样为标准样，按蛋白质

含量40.50.60.70.80.90.100.110mg分别取样于8支50ml管子中，各加1mlCCl4再用碱性CuSO4稀释至50ml，振摇10min，静置1hr，取上层清液，离心5min，取上清于比色皿中，560nm以蒸馏水为参比测O.D.，以pro含量横作标，O.D.为纵坐标，制标准曲线。②样品测定：取样品（蛋白质含量40~110mg）按上述步骤操作。第57页,共66页，202