线粒体DNA异常与肿瘤的相关性

-PAGE14-线粒体DNA异常与肿瘤的相关性摘要：线粒体DNA（mtDNA）是真核细胞中唯一独立于核DNA之外的遗传物质，其特殊的环境、结构与功能以及在肿瘤细胞中所表现出的高比率异常，提示mtDNA与肿瘤发生之间存在密切的相关性。mtDNA异常与肿瘤之间的相互关系及其作用和调控机制仍是当前研究热点。关键词：线粒体DNA，肿瘤线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）是真核细胞中唯一存在的独立于核DNA之外的遗传物质，被称为“人类第25号染色体”。近年来在多种肿瘤组织中相继发现了线粒体DNA异常，而且线粒体DNA的突变率明显高于核基因，目前趋向认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质，而且与核外线粒体DNA密切相关，线粒体DNA异常可能参与肿瘤发生。1线粒体DNA的结构与功能特点Aderson等人于1981年首先完成对人类mtDNA全序列的测定[1]。mtDNA是一条全长16569bp的双链闭环分子，一条为重链（H链），含较多鸟嘌呤，是12S和16SrRNA基因、14种tRNA基因及12种蛋白多肽基因的模板，另一条为轻链（L链），含较多胞嘧啶，是8种tRNA基因和1种蛋白多肽基因的模板。mtDNA基因组内编码的13种蛋白多肽分布为：复合体Ⅰ（NADH-泛醌还原酶，NADHdehydogenase-uˉbiquineneoxidoreductase，ND）中7个亚基（ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6）；复合体Ⅲ（泛醌-细胞色素C还原酶，ubiquinone-cytodhromecoxidoreductase）中1个亚基（Cytb）；复合体Ⅳ（细胞色素C氧化酶，cytochromecoxidase，CO）中3个亚基（COⅠ，COⅡ，COⅢ）和复合体V（ATP合酶，ATPsynthase）中2个亚基（ATPase6和ATPase8）。以上13种多肽均是呼吸链的组成成分。mtDNA相邻基因间极少有非编码基因，D环（D-Loop）区是mtDNA的主要非编码区，位于16028bp-577bp，约占全部mtDNA的6%（约1120bp），富含A-T碱基，包括3个高变区：16024-16324bp为高变区Ⅰ（HVⅠ），63-322bp为高变区Ⅱ（HVⅡ），438-574bp为高变区Ⅲ（HVⅢ）。D环区有mtDNA复制的起始位点和转录启动子，对mtDNA复制和转录具有调控作用。mtDNA可独立于核DNA之外自主地进行复制、转录和翻译，具有非常活跃的自我复制能力。mtDNA的基因结构全部是外显子，没有内含子，散发的DNA突变通常就可导致DNA序列的改变，造成蛋白质表达的变化。2导致线粒体DNA异常的主要因素mtDNA结构简单，缺乏组蛋白和非组蛋白保护，环境特殊，处在活性氧及其他自由基包围之中；mtDNA分子量小，无内含子，在整个细胞周期中处于不断合成的状态，而负责mtDNA复制的DNA聚合酶γ校对能力差，而且mtDNA由D环区单链启动复制，容易在tRNA基因部位出现发夹样结构，mtDNA还缺乏有效的损伤修复系统，因此，mtDNA易受各类诱变因素作用而发生损伤和异常，其突变率比核DNA高10-20倍[2]。2.1ROS氧化损伤在可能导致mtDNA突变的环境有害因子中，研究较多的是活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）。mtDNA位于线粒体基质内，并靠近内膜电子传递链，直接暴露于线粒体内高氧环境，人体内90%以上的氧消耗直接与线粒体的呼吸链相联系，线粒体在呼吸链代谢中产生超氧粒子，在电子转运过程中生成的大量ROS以及过氧化物，线粒体本身不能合成谷胱甘肽将过氧化物有效清除，因此，当ROS产生过多或抗氧化防御系统作用减弱时，线粒体内氧自由基容易出现累积，可诱发mtDNA点突变，点突变可提高DNA双链的分离机会，促使mtDNA进一步发生核酸大片断丢失、断裂、碱基修饰和插入等不同形式的变异[3]。2.2致癌物结合mtDNA与富含脂质的线粒体内膜相连，线粒体内脂肪/DNA的比值较高，使mtDNA对脂溶性化学物质非常敏感，并往往成为亲电子物质首选的靶点，具有嗜脂性的致癌物往往优先在mtDNA上聚集。在用亲脂肪硫氰酸MKT-077体外处理肿瘤细胞与正常细胞的实验中,结果表明在两种细胞中，MKT-077与mtDNA的结合量均显著高于与核DNA的结合量[4]。用同样的方法，以14C标记多种化学致癌剂体外处理培养细胞，一致表明致癌物与mtDNA的结合率相对核DNA高：烷化类致癌剂与mtDNA的结合率是核DNA的5倍；苯并芘与mtDNA的结合率为核DNA的40-90倍；多环香烃与mtDNA的结合率为核DNA的50-500倍；黄曲霉素B1与肝细胞mtDNA的结合率是核DNA的3-4倍，而且这些结合不易消除，可在线粒体内持续存在24h以上。mtDNA与致癌剂共价结合的反应产物是7-甲基鸟嘌呤，常导致mtDNA链断裂。3肿瘤细胞的线粒体DNA异常根据近10年来的文献报道，在人类多种实体瘤，包括头颈、食管、乳腺、肺、胃、肝脏、胰腺、结肠、肾、膀胱、前列腺和卵巢等处的恶性肿瘤细胞中均发现mtDNA突变或表达异常，在血液系统恶性肿瘤中也发现mtDNA异常，如白血病患者肿瘤细胞中存在特异性的mtDNA环状二聚体结构[5]。肿瘤细胞的mtDNA异常主要表现为：3.1mtDNA突变研究显示不同组织发生的肿瘤mtDNA突变位点、突变形式和突变程度并不一致，这可能是由于不同的组织肿瘤发生所必需mtDNA突变率、线粒体的数目和细胞分化固有的数目存在差异[6]。已报道的肿瘤mtDNA突变类型多数为单碱基替换（从T→C和G→A），而且D环区是体细胞mtDNA突变的频发位点[7]。现就研究较多的消化系统肿瘤mtDNA突变特点作一简介：Polyak等于1998年首次通过对10例结肠癌细胞系和原发性肿瘤中mtDNA全基因组测序，发现了7例（70%）伴有mtDNA体细胞同质性突变。在12种突变形式中，有11/12是单个碱基的替换，1/12是插入突变，实验还发现mtDNA的突变比核DNA突变至少多10倍[8]。Habano等在45例结肠癌组织中发现有7/45（16%）存在mtDNA突变，包括3例编码区ND1和ND5的移码突变，2例错义突变，1例15bp的缺失，没有发现大片段的缺失[9]。在对胃癌组织的研究中，相关结果显示胃癌可能更倾向于发生mtDNA大片段的缺失，这与结肠癌多倾向于点突变的发生有所不同。Maximo等发现在32例原发胃癌病例中有17例（53%）存在mtDNA4977bp大片段的缺失，突变大多发生于D环区和ND1、ND2区[10]。Burgart等对32例胃腺癌mtDNA进行突变检测，发现4/32（12.5%）例D环区存在50bp的缺失[11]。Habano研究了胃癌患者的8个编码基因和D环非编码的（C）n序列，发现有ND（ND1、ND5）基因的突变[12]。Hiyama等检测了56例胃癌患者肿瘤组织中的mtDNA，结果发现有9例（16%）存在mtDNA的突变，而且在癌组织中mtDNA的突变率明显高于非癌组织（12%vs1%），差异有显著性（P=0.008）[13]。上述证据表明，胃肠道肿瘤组织中mtDNA的突变情况是不一致的。mtDNA中的D环区紧靠电子传递链，而且D环区是mtDNA复制转录的调控区，由此可推测D-环区可能是mtDNA突变的热点区域，而许多报道也支持了这一假想：Nishikawa等对59例肝癌肿瘤组织及相应的癌旁组织中mtDNA进行检测，结果发现在D环区的100～600bp的碱基之间突变频率最高，所有突变均为260bp处G→A，489bp处T→C的单碱基替换，以及311→312bp之间的C插入[14]。另外，Nomoto等检测了19例肝细胞癌患者的肿瘤组织，发现有13/19（68%）例存在mtDNAD环区的突变[15]。Okochi等对50例肝细胞癌病人进行了检测，结果在肿瘤组织中发现的100处基因变异中有17/50例（34%）发现了D环区的突变，并且在随后的匹配血浆检测中，有5/15例（33%）在其相应的血浆中检测到了一致的mtDNA突变[16]。3.2线粒体微卫星不稳（mtMSI）人类基因组中微卫星DNA不仅位于核基因组，也存在于线粒体DNA中，约占基因组的10％。迄今线粒体基因上累积的多态性位点（表现为不稳定性）接近1000个，其中D环区的多态性位点多达400余个。肿瘤细胞呈现的线粒体微卫星不稳定（MitochondrialMicrosatelliteInstability，mtMSI）或线粒体基因组不稳定（MitochondrialGenomeInstability，mtGI）形式以D环区的（CA）n和polyC不稳定最为常见。出现mtMSI的原因可能是活性氧的破坏、滑链错配和不平衡交换，16189位点的碱基替换也可能导致polyC长度不稳定。Habano等对62例胃癌细胞核和线粒体微卫星不稳定性的检测表明，16％（10/62）表现为mtMSI（polyC不稳定），5例编码区基因发生突变者有4例合并mtMSI表型，并发现mtMSI与核微卫星（nMSI）不稳定呈正相关[9]。不过，Maximo等的研究结果提示mtMSI和nMSI并无相关关系，MSI与mtDNA编码区突变无密切关系[10]。凌贤龙等对30例胃癌进行检测，检出mtMSI11例（36.7％），反映出胃癌mtMSI是常见现象，实验还发现，在浅表性胃炎→萎缩性胃炎→胃癌前病变→胃癌的过程中，mtMSI有增加趋势，mtMSI发生于胃粘膜癌变的早期阶段，提示mtMSI可能与胃癌发生发展有关[17]。此外，Jeronimo等检测16例前列腺癌，发现3例存在mtDNA多位点突变，同时呈现高频率mtMSI[18]。3.3mtDNA数目、转录和表达水平变化有研究发现，神经胶质瘤细胞mtDNA的拷贝数明显较正常细胞增多，所有急性白血病和大部分慢性白血病患者的mtDNA也显著增加。Simonnet等对25例肾肿瘤（包括肾嗜酸性细胞瘤，肾细胞癌透明细胞型和嗜酸细胞型）组织中的线粒体酶、mtDNA以及氧化磷酸化蛋白含量进行检测，结果显示，mtDNA的损伤与肿瘤的侵袭性呈正相关，肾嗜酸细胞瘤细胞中，三项指标较恶性肿瘤高3-4倍，而复合体Ⅴ在肾肿瘤细胞中的含量均下降[19]。肿瘤细胞mtDNA数目增加可能与mtDNA复制失控有关，胡义德等提出，T碱基突变可降低GC含量，削弱复制起始区双键之间的结合力，引起mtDNA复制启动易化[20]。不同癌组织中出现转录水平改变的线粒体编码区基因并不一致，例如：在人结肠腺癌细胞系HT-29中，ND4、ND4L、cytb、COXⅢ、ATPase6、ATPase8以及16srRNA的转录水平增高，但在乳腺癌组织中，ND2、ND4、ATPase6的表达并未发生变化，仅COXⅡ表达增加[21]。4线粒体DNA异常参与肿瘤发生的可能机制4.1mtDNA突变导致细胞氧化应激和细胞凋亡抑制从而诱导肿瘤发生理化、生物等外源性致癌物和氧自由基等内源性损伤因子引起的mtDNA突变，无论是发生在D环非编码区还是编码区，都将间接或直接影响线粒体电子传递链的氧化磷酸化系统，最终导致持续的细胞氧化应激而促进肿瘤发生和发展。肿瘤细胞中mtDNA发生突变与肿瘤细胞内高水平的ROS是一致的，各种原因引起mtDNA突变导致呼吸链代谢障碍，削弱正常呼吸功能，释放高水平ROS，ROS又可导致新的突变发生，形成恶性循环。ROS可以对细胞成分包括核基因组(如癌基因和抑癌基因)造成损伤，可以促进nDNA突变和细胞分裂，使细胞获得选择性增生的优势。在一些线粒体基因组中，生命进程中突变的mtDNA逐渐积聚直至起主导作用时，可引起氧化磷酸化功能缺失，尤其在能量需求较高的脑和骨骼等组织，可出现与代谢相关的遗传病和衰老,包括引发早期癌症。肿瘤发生机制之一是细胞凋亡受阻而永生化，而线粒体在细胞凋亡调控中起重要作用。mtDNA突变导致线粒体功能异常，释放的激活凋亡诱导因子Caspase3家族的蛋白酶和细胞色素C减少，细胞凋亡受到抑制，而高ROS还引起Bcl-2和Bcl-XL的过表达并增强其抗凋亡作用，相反促凋亡蛋白Bid和Bax表达下降，从而诱导肿瘤发生。4.2mtDNA突变的非随机分离引起恶性转化各种损伤因子首先导致少量异质性mtDNA突变，异质性细胞在连续分裂的过程中会出现突变型和野生型的比例改变，如果突变使得细胞获得生长或是mtDNA复制的优势，例如mtDNA突变导致线粒体功能缺陷，只有过多复制使之从数量上增加才能获得补偿，致使异质性mtDNA突变具有选择性的生存优势，逐渐取代野生型mtDNA并最终转变为同质性，异质性mtDNA突变积累到一定程度则导致细胞向恶性转化及肿瘤发生[22]。4.3mtDNA分子及其片段在核基因组中整合细胞内受损伤线粒体在短期内大量崩解产生的游离mtDNA及其片段，以及一部分线粒体RNA在胞质中逆转录成的mtDNA，可类似致瘤病毒，通过核膜，随机整合到核DNA（nDNA）中。对HelaTG细胞的研究发现，mtDNA的细胞色素氧化酶亚单位Ⅲ(CoⅢ)基因在核基因组中发生整合，整合位于c-myc基因组内。整合后使细胞产生了融合的mRNA，不仅含有来自c-myc遗传信息而且含有CoⅢ的遗传信息。这一发现提示mtDNA在nDNA内的整合可能是诱发细胞癌变的重要机制之一[23]。mtDNA在nDNA内的整合可能通过两条途径引起细胞癌变：①通过引起核基因组的不稳定性发生癌变；②通过改变细胞能量产生，提高线粒体氧化压力，引起线粒体酶表达异常和/或调控凋亡等途径来影响细胞的生物学行为，使其发生恶变。5问题尽管越来越多的证据支持mtDNA异常具有致病性，在肿瘤发生机制中起重要作用，mtDNA突变和mtMSI作为肿瘤非侵入性临床诊断的分子标记物也得到了广泛的支持，但迄今为止mtDNA与肿瘤之间相关性的研究还仅局限于对mtDNA改变的检测和对可能机制的推测，而且不同部位的实体性肿瘤中mtDNA的突变和不稳定性不很一致，因此，尚无法在整体水平上分析它们之间的关系和规律。对现有研究结果，不少学者也提出了质疑：mtDNA突变可能只是一个随机事件，与肿瘤发生无关，而D310区（实体瘤突变热点）的插入或缺失突变可能仅反映了D环区的高变性（多态性），并不一定表明存在线粒体微卫星不稳。Polyak在结直肠癌的细胞系中发现的mtDNA的高突变率，可能是体外培养的肿瘤细胞的持续进化对mtDNA产生了比对nDNA更为严重影响的结果。AntonioSalas和他的同事最近在PLoSMedicine发表了一篇题为“ACriticalReassessmentoftheRoleofMitochondriainTumorigenesis”的论文[24]，他们从“系统发生学”的角度，利用基因数据库，对近年著名国际学术期刊上发表的阐述mtDNA与肿瘤发生相关性的论文中的mtDNA测序结果进行了严格比对，结论是：论文中所有的mtDNA异常证据存在明显的错误，根据他们的分析，提供mtDNA测序的样品要么是受污染的要么是混合物，不能体现mtDNA在肿瘤发生中的作用。目前对这一结论仍在争论中，至少它对探究mtDNA与肿瘤相互关系提出了更高的要求。参考文献PFChinneryandEASchon.Mitochondria.JNeurolNeurosurgPsychiatry,2003,74:1188-1199CopelandWC,WachsmanJT,JohnsonFM,etal.MitochondrialDNAalternationincancer.CancerInvest,2002,20(4):557-569SantosJH,HunakovaL,ChenY,etal.CellsortingexperimentslinkpersistentmitochondrialDNAdamagewithlossofmitochondrialmembranepotentialandapoptoticcelldeath.JBiolChem,2003,278(3):1728-1734ModicaJS,KoyaK,WeisbergE,etal.SelectivedamagetocarcinomamitochondriabythethodacyanineMKT-077.CancerRes,1996,56:544CarewJS,HuangP.Mitochondrialdefectsincancer.Mol-Cancer,2002,1(1):9SanchezCespedesM,ParrellaP,NomotoS,etal.IdentificationofamononucleotiderepeatasamajortargetformitochondrialDNAalterationsinhumantumors.CancerRes,2001,61(10):7015-7019NomotoS,YamashitaK,KoshikamaK,etal.MitochondrialD-loopmutationsasclonalmarkerinmulticentrichepatocellularcarcinomaandplasma.ClinCancer,2002,8(2):481-487PolyakK,LiYB,ZhuH,etal.Somaticmutationofthemitochondrialgenomeinhumancolorectaltumors.NatureGenet,1998,20:291-293HabanoT,SugaiT,YoshidaT,etal.Mitochondrialgenemutation，butnotlarge-scaledeletion，isafeatureofcolorectalcarcinomaswithmitochondrialmicrosatelliteinstability.IntJCancer,1999,83:625-629MaximoV,SoaresP,SerucaR,etal.Microsatelliteinstability,mitochondrialDNAlargedeletions,andmitochondrialDNAmutationsingastriccarcinoma.GenesChromosomesCancer,2001,32(2):136-143BurgartIJ，ZhengJ，ShuQ，etal.Somaticmutationofthemitochondrialgenomeinhumancolorectaltumors.AmJPathol，1995，147（4）:1105-1111HabanoW，SugaiT，NakamuraSI，etal.MicrosatelliteinstabilityandmutationofmitochondrialandnuclearDNAingastriccarcinoma.Gasˉtroenterology，2000，118（5）:835-841HiyamaT，TanakaS，ShimaH，etal.SomaticmutationofmitochondrialDNAinhelicobacterpylori-associatedchronicgastritisinpatientswithandwithoutgastriccancer.IntJMolMed，2003，12（2）:169-174NishikawaM，NishiguchiS，ShiomiS，etal.SomaticmutationofmitoˉchondrialDNAincancerousandnoncancerouslivertissueinindividualswithhepatocellularcarcinoma.CancerRes，2001，61（5）:1843-1845ShujiN，KatsuyaY，KatsumiK，etal.MitochondrialD-Loopmutationasclonalmarkersinmulticentrichepatocellularcarcinomaandplasma.ClinCancerRes，2002，8:481-487OkochiO，HibiK，VemuraT，etal.DetectionofmitochondrialDNAalˉterationsintheseurmofhepatocellularcarcinomapatients.ClinCancerRes，2002，8（9）:2875-2878LingXL,FangDC,ZhouXD,etal.MitochondrialDNAinstabilityandintegrationofmtDNAinthenucleiofgastricmucosarelatedtoHelicobacterpyloriinfection.ChinJDig,2003,23(2):80-83JeronimoC,NomotoS,CaballeroOL,etal.Mitochondralmutationinearlystageprostatecancerandbodilyfluids.Oncogene,2001,20:5159SimonnetH,AlazardN,PfeiflerK,etal.Lowmitochondrialrespiratorychaincontentcorrelateswithtumoraggressivenessinrenalcellcarcinoma.Carcinogenesis,2002,23(5):759-768胡义德,钱桂生,李淑平,等.人癌细胞线粒体DNA控制区序列特征分析.遗传,1999,21(4):1-5ParellaP,XiaoY,FlissM,etal.DetectionofmitochondrialDNAmutationsinprimarybreastcancerandfine-needleaspirates.CancerRes,2001,61(20):7623-7626BianchiNO,BianchiMS,RichardSM.Mitochondrialgenomeinstabilityinhumancancers.MutatRes,2001,488(1):9-23ShayJW,BabaT,ZhaoQ,etal.HelaTGcellshavemitochondrialDNAinsertedintothec-myconcogene.Oncogene,1991,6(10):1869-1875SalasA,YaoYG,MacaulayV,etal.Acriticalreassessmentoftheroleofmitochondriaintumorigenesis.PLoSMed,2005,2(11):e296（2005.11.20）P.S.重要的三篇基本参考文献：CopelandWC,WachsmanJT,JohnsonFM,etal.MitochondrialDNAalternationincancer.CancerInvest,2002,20(4):557-569Abstract:AnumberofstudieshavedemonstratedthepresenceofmitochondrialDNA(mtDNA)mutationsincancercells.Inthisarticle,wereviewmitochondrialgenomicaberrationsreportedinsolidtumorsofthebreast,colon,stomach,liver,kidney,bladder,head/neck,andlung.ThetantalizingassociationoftumorswithmtDNAmutationsimplicatesthesemutationsintheprocessofcarcinogenesis.AlterationsinexpressionofmtDNAtranscriptsinavarietyofcancertypesarealsoreviewed.Insolidtumors,elevatedexpressionofmtDNA-genescodingforsubunitsofthemitochondrialelectronrespiratorychainmayreflectmitochondrialadaptationtoperturbationsincellularenergyrequirements.TheroleofmtDNAmutationsandalteredexpressionofmitochondrialgenesincarcinogenesisisdiscussed.MitochondrialDNAmutationscaninitiateacascadeofeventsleadingtoacontinuousincreaseintheproductionofreactiveoxygenspecies(persistentoxidativestress),aconditionthatprobablyfavorstumordevelopment.CarewJS,HuangP.Mitochondrialdefectsincancer.Mol-Cancer,2002,1(1):9Abstract:Mitochondriaplayimportantrolesincellularenergymetabolism,freeradicalgeneration,andapoptosis.Defectsinmitochondrialfunctionhavelongbeensuspectedtocontributetothedevelopmentandprogressionofcancer.Inthisreviewarticle,weaimtoprovideabriefsummaryofourcurrentunderstandingofmitochondrialgeneticsandbiology,reviewthemtDNAalterationsreportedinvarioustypesofcancer,andoffersomeperspectiveastotheemerg