化学工艺学：培养基的灭菌和空气除菌

第四节培养基的灭菌和空气除菌1灭菌的原理和方法灭菌就是采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切有生命物质永远丧失其生长繁殖能力的措施。返回常用的灭菌方法3.化学试剂灭菌法

甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒4.射线灭菌法电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱5.过滤除菌法

利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气

6.火焰灭菌法

火焰适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口

1.干热灭菌法

常用烘箱，灭菌条件：160℃下保温1h适用范围：金属或玻璃器皿2.湿热灭菌法

利用饱和蒸汽灭菌，条件：121℃，30min适用范围：生产设备及培养基灭菌2培养基的灭菌培养基灭菌最基本的要求是杀死培养基中混杂的微生物，再接入菌种以达到纯种培养的目的。目前，微生物培养基的灭菌方式主要采用湿热灭菌。湿热灭菌原理灭菌条件灭菌不利方面蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。

121℃，30min。

同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌致死温度:杀死微生物的极限温度致死时间:在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。热阻:指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。相对热阻:微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3空气过滤除菌流程空气除菌方法1.热杀菌利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌

2.静电除菌利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌3.介质过滤除菌让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.1空气过滤除菌流程的要求过滤除菌的流程必须具有：供气设备—空气压缩机；高效的过滤除菌设备。在环境污染比较严重的地方要改变吸风的条件（如采用高空吸风）；在温暖潮湿的地方则要加强除水设施以确保和发挥过滤器的最大除菌效率；在压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.2空气过滤除菌流程的分析两级冷却、加热除菌流程尤其适用于潮湿的地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。两级冷却、加热除菌流程1-粗过滤器2-压缩机3-贮罐4,6-冷却器5-旋风分离器7-丝网分离器8-加热器9-过滤器生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.2空气过滤除菌流程的分析特点：省去第二级冷却器和空气加热器，流程比较简单，利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少等。该流程适用于中等湿含量地区，但不适合于空气湿含量高的地区。冷热空气直接混合式空气除菌流程1-粗过滤器2-压缩机3-贮罐4-冷却器5-丝网分离器6-过滤器生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.2空气过滤除菌流程的分析特点：采用了高效率的前置过滤设备，使空气经多次过滤，因而所得的空气无菌程度比较高。高效前置过滤器采用聚氨酯泡沫塑料(静电除菌)和超细纤维纸串联使用作为过滤介质。高效前置过滤空气除菌流程1-高效前置过滤器2-压缩机3-贮罐4-冷却器5-丝网分离器6-加热器7-过滤器生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.2空气过滤除菌流程的分析特点：利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度利用热空气加热冷空气的流程示意图1-高空采风2-粗过滤器3-压缩机4-热交换器5-冷却器6,7-析水器8-空气总过滤器9-空气分过滤器生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.2空气过滤除菌流程的分析特点：将压缩空气冷却至露点以下，析出部分水分，然后升温使相对湿度为60%左右，再进入空气过滤器。一次冷却和析水的空气过滤流程示意图1-高空采风2-粗过滤器3-压缩机4-冷却器5,6-析水器7-贮气罐8-加热器9-空气总过滤器10-空气分过滤器生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.3空气过滤除菌的机制和过滤介质空气过滤除菌的机制当气流通过滤层时由于滤层纤维网格的层层阻碍，迫使气流无数次改变运动速度和运动方向而绕过纤维前进，从而导致微粒对滤层纤维产生惯性冲击、重力沉降、拦截、布朗扩散、静电吸附等作用，把微生物滞留在纤维表面。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌布朗扩散截留作用直径很小的微粒在运动中往往产生一种不规则的布朗运动，使微粒间相互凝集成较大的粒子，从而发生重力沉降或被介质截留。但是这种作用只有在气流速度较低时才较显著。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌阻拦截留作用微粒随空气气流向前运动，当气流为层流时，随气流运动的粒子在接近纤维表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附捕集，这种作用称之为阻拦截留。空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦截留作用愈大。但是在介质过滤的除尘除菌中，阻拦截留并不起主要作用。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌惯性撞击截留作用空气气流流速大时，气流中的粒子具有较大的惯性力。当粒子随气流以一定速度向纤维垂直运动，因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于粒子具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生摩擦黏附而使粒子被截留在纤维表面，这种作用称惯性碰撞截留。空气流速过低时，惯性撞击截留作用很少，甚至接近于零，当空气的流速增大时，惯性撞击截留作用起主导作用。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌重力沉降作用重力沉降是一个稳定的分离作用，当粒子所受的重力大于气流对它的拖带力时，粒子就容易沉降。一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，粒子的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌静电吸引作用干空气对非导体的物质相对运动磨擦时，会产生诱导电荷，纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。常见的空气过滤除菌介质有棉花、玻璃纤维、活性炭、玻璃纤维纸、石棉滤板以及烧结材料过滤介质等。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌3.4提高过滤除菌效率的措施（1）减少进口空气的含菌数;（2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质;（3）设计合理的空气预处理设备，以达到除油、水和杂质的目的;（4）降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤质能在干燥状态下工作。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌4发酵染菌及其防治发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物污染了发酵液，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养。为了防止染菌，人们使用了一系列的设备，不断改进生产工艺，对发酵罐、管道和其他附属设备、培养基及空气等过程严格灭菌。除对水、电、汽、无菌空气严格按无菌要求供应外，还健全了生产技术管理制度，大大降低了生产过程的染菌率。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌4.1染菌对发酵的影响染菌对不同发酵过程的影响杂菌的种类和性质对发酵过程的影响染菌发生的时间不同对发酵的影响种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌和发酵后期染菌染菌程度对发酵的影响生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌4.2发酵染菌的途径和防治种子带菌及其防治原因：种子保存管染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养所涉及的设备和装置染菌等。防治措施：根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，间替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。种子的转移、接种等在超净工作台上操作。在制备种子时沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格加以灭菌。对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查。对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌4.2发酵染菌的途径和防治空气带菌及其防治防治措施：加强生产场地的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，采用提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理等，提高空压机进口空气的洁净度。设计合理的空气预处理过程，尽可能减少空气的带油、水量。设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治原因：设备的渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀、电化腐蚀、磨蚀、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。“死角”是指由于操作、设备结构、安装及其他人为因素造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌空气分布管中污垢堆积造成“死角”措施：采取频繁更换空气分布管或认真洗涤等生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌不锈钢衬里破裂形成“死角”发酵罐罐底形成的“死角”法兰的“死角”生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌发酵罐底常有培养基中的固形物堆积，通过加强罐体清洗、适当降低搅拌桨位置都可减少罐底积垢，减少染菌法兰的加工、焊接和安装要符合灭菌的要求，务必使各衔接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片的内径与法兰内径匹配、安装时对准中心甚至尽可能减少或取消连接法兰等措施，以避免和减少管道出现“死角”而染菌生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌培养基灭菌不彻底导致的染菌灭菌时温度与压力不对应造成染菌，在灭菌升温时，要打开排气阀门，使蒸汽能通过并排尽罐内空气，一般可避免此类染菌。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌，添加消泡剂防止泡沫的大量产生连续灭菌维持时间不够而造成染菌，应严格控制灭菌的温度，最好采用过程自动控温灭菌过程中的压力剧变而造成染菌，一般操作上在进行冷却前需先通入无菌空气维持罐内压力，然后进行冷却一些仪器探头等灭菌不彻底造成的染菌，一般常采用化学试剂浸泡等方法来灭菌生物化工反应单元操作——培养基的灭菌和空气除菌噬菌体染菌及其防治原