治疗基因向脑内递送

关于治疗基因向脑内递送2掌握要点1.血脑屏障的功能2.物质透过血脑屏障的途径第2页,共72页，2024年2月25日，星期天3第一节血脑屏障及血脑肿瘤屏障一、阻止药物进入脑肿瘤内的屏障

（一）脑屏障脑屏障是在生理情况下,存在于脑和脊髓内的毛细血管与神经组织之间的一个调节界面。它能选择性地调节进入神经组织的物质,从而使神经细胞和神经胶质细胞保持恒定的内、外环境，保证正常的生理活动。脑屏障包括：

血脑屏障

血脑脊液屏障

脑脊液-脑屏障第3页,共72页，2024年2月25日，星期天4BloodSupplyoftheBrainArterialsupplyofthebrainisderivedfrom2pairsofvessels:

InternalCarotidArteries

andthe

VertebralArteries.第4页,共72页，2024年2月25日，星期天5第5页,共72页，2024年2月25日，星期天61.血-脑屏障血脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB） 由脑毛细血管内皮细胞、基膜和神经胶质细胞的终足三层隔膜共同构成。

第6页,共72页，2024年2月25日，星期天7脑毛细血管：

总长：约600km

表面积：约20m2

每cm3脑组织：1km长

每个神经元都有自己的供给人脑血管铸型图第7页,共72页，2024年2月25日，星期天8血脑屏障第8页,共72页，2024年2月25日，星期天9TheBlood-BrainBarrierBodycapillaries:Loosejunctionbetweenendothelialcells.Permeabletomanysubstances.Braincapillaries:Tightjunctionbetweenendothelialcells.CoveredbyastrocytefeetImpermeabletomanysubstances.第9页,共72页，2024年2月25日，星期天10第10页,共72页，2024年2月25日，星期天11内皮细胞的紧密连接(tightjunction,TJ)TJ是中枢神经系统毛细血管特有的解剖学特征，也是BBB的重要结构基础。TJ的存在极大的限制了BBB的细胞旁转运途径。第11页,共72页，2024年2月25日，星期天12紧密连接第12页,共72页，2024年2月25日，星期天13Proteincomponents:ClaudinOccludinJunctionAdhesionMoleculesAccessoryproteins：ZO-1,2,3cingulin,etc第13页,共72页，2024年2月25日，星期天14TheTJconsistsofthreeintegralmembraneproteins:Claudin,OccludinandJunctionadhesionmolecules.Cytoplasmicaccessoryproteins:ZO-1(zonulaoccludens),ZO-2,ZO-3,cingulin,andothers.Theprimarycytoskeletalprotein,actin,hasknownbindingsitesonalloftheZOproteins,andonclaudinandoccludin.第14页,共72页，2024年2月25日，星期天15Claudins:makeupthebackboneofTightJunctionstrandsbyformingdimersandbindinghomotypicallytoclaudinsonadjacentcellstoproducetheprimarysealofthetightjunction.Occludin:functionsasadynamicregulatoryprotein,whosepresenceinthemembraneiscorrelatedwithincreasedelectricalresistanceacrossthemembraneanddecreasedparacellularpermeability.Zonulaoccludensproteins(ZO1,ZO2andZO3):belongtoafamilyofproteinsknownasMAGUKs(membraneassociatedguanylatekinase-likeproteins),whichserveasrecognitionproteinsforTightJunctionplacementandasasupportstructureforsignaltransductionproteins.

第15页,共72页，2024年2月25日，星期天16Cingulin:isadouble-strandedmyosin-likeproteinthatserveasascaffoldingproteinthatlinksTightJunctionaccessoryproteinstothecytoskeleton.Actin:AdensebandofactinandmyosinfilamentscircumscribethecellwithactinfilamentsthatextendintotheTightJunctions.ZO1bindstoactinfilamentsandtheCterminusofoccludin,whichcouplesactintotheparacellularbarrier.Severalstudiessuggestthattightjunctionalintegrityisdependentonstructuralorganizationofactin.第16页,共72页，2024年2月25日，星期天RegulationofTightJunctionsFactorswhichincreasepermeability(ExtracellularFactors):Membranepermeabilityincreasesafterexposureto:Cytokines:TNFα,IL-1βandIFN-γGrowthfactors:VEGF,FGF2NitricOxide,ATP,histamine,bradykinin,5-HT,Endothelin-1,thrombin,substanceP,plateletactivatingfactorandfreeradicalsAminoacids:glutamate,AspartateHypoxicinsultsleadingtoATPdepletion,suchaswouldoccurwithanischemicstrokeLeukocytemigrationintobrainhasbeenshowntotriggersignaltransductioncascadesleadingtolossofTightJunctionmoleculesincludingoccludinandzonulaoccludensandBBBbreakdown.第17页,共72页，2024年2月25日，星期天IntracellularsignalingFactorswhichincreasepermeabilityZOandoccludinmoleculesareprimaryregulatoryproteinsoftightJunctionsthatmodulatesBBBpermeability.OccludinandZO1arephosphorylatedonSerine,ThreonineandTyrosineresidues.Tyrosinephosphorylationcorrelateswithdecreasedoccludinexpression,andincreasedpermeability.IntracellularcGMPActivationoftheRhofamilyofsmallGTPbindingproteinstriggersreorganizationofperijunctionalactin,whichleadstoincreasedparacellulardiffusion.ATPdepletionleadstomarkedreorganizationofthecytoskeletonandincreasedpermeability.第18页,共72页，2024年2月25日，星期天Factorswhichdecreasepermeability(extracellular):GlialCellDerivedNeurotrophicFactorTransformingGrowthFactorβ1HydrocortisoneAstrocyteproximity

第19页,共72页，2024年2月25日，星期天Intracellularfactors:ProteinKinaseCisamajorregulatoroftightJunctionformationandregulation.RaisingextracellularcalciumincreasesresistanceacrossthemembraneanddecreasesthepermeabilitymediatedthroughheterotrimericGproteinandproteinkinaseC(PKC)signalingpathways.cAMP第20页,共72页，2024年2月25日，星期天21基膜（basementmembrane） 是围绕在毛细血管内皮周围的一层完整连续的网状膜，形成血脑屏障的第二道隔膜。 它主要由IV型胶原和层粘蛋白构成，起支持作用，防止由于静水压和渗透压改变引起的血管变形。第21页,共72页，2024年2月25日，星期天22基膜第22页,共72页，2024年2月25日，星期天23神经胶质细胞：是血脑屏障的第三道隔膜。 神经胶质细胞（主要是星形胶质细胞）的突起形成伪足，伸向血管壁周围，包绕基膜，起着机械的屏障作用，限制毛细血管的通透性。 星形胶质细胞有诱导和维持血脑屏障完整性的作用。第23页,共72页，2024年2月25日，星期天24周细胞

是BBB的重要细胞成分,在脑血管发生、内皮细胞紧密连接形成、BBB分化和结构稳定性中起着调节作用。持续产生转化生长因子-β(TGF-β)来诱导和上调BBB的功能。具有巨噬细胞功能,能够积极参与BBB调控的神经免疫网络。第24页,共72页，2024年2月25日，星期天25体外血脑屏障模型的建立第25页,共72页，2024年2月25日，星期天26体外血脑屏障模型通透性的评价第26页,共72页，2024年2月25日，星期天27Paracellulartransport/sodiumfluoresceine(Na-F,376Da)体外血脑屏障模型通透性的评价第27页,共72页，2024年2月25日，星期天28Brainpericytesareplatedatthelowersideofinserts(A),astrocytesatthebottomofthewells(B),andbrainendothelialcellsattheuppersideofthesameinserts(C)toreconstitutetheBBBinvitroApericytesBastrocytesCendothelialcells体外血脑屏障模型建立的过程第28页,共72页，2024年2月25日，星期天29体外血脑屏障模型特性的评价NakagawaS,DeliMA,NakaoS,HondaM,HayashiK,NakaokeR,KataokaY,NiwaM:

Pericytesfrombrainmicrovesselsstrengthenthebarrierintegrityinprimaryculturesofratbrainendothelialcells.CellularandMolecularNeurobiology27(6):678-694,2007第29页,共72页，2024年2月25日，星期天30体外血脑屏障模型特性的评价第30页,共72页，2024年2月25日，星期天31SubstancesSubstancesthatenterintothebrain -O2,CO2,N2-glucose,aminoacids,certainions -smallfatsolublemolecules(ethanol) -watersolublemolecules(aqueouschannelprotein)第31页,共72页，2024年2月25日，星期天32SubstancesSubstancesthatcannotenterintothebrain -largeprotein -toxins -antibodies -monoamines(e.g:neurotransmitter)第32页,共72页，2024年2月25日，星期天33脑室周围小器官（

Circumventricularorgans,CVO）或“脑的特殊区”

脑的某些部位：海绵窦、垂体后叶、正中隆起、松果体、视丘、穹隆下器官、脑极后区、脉络丛等区域缺少血-脑屏障。第33页,共72页，2024年2月25日，星期天34血脑屏障的功能1.阻止外源性毒素及全身性递质进入脑内。2.避免脑组织自身神经递质的流失。3.控制葡萄糖和乳酸盐进入脑内。4.酶屏障阻止一些代谢产物进入脑内，选择性地将脑内一些有害物质泵出脑外。第34页,共72页，2024年2月25日，星期天352．血脑脊液屏障血脑脊液屏障（bloodcerebrospinalfluidbarrier） 是存在于血液与脑脊液之间的生理性屏障，主要位于脑室脉络丛处。基本结构由毛细血管内皮细胞、软脑膜和室管膜上皮三层组成。

毛细血管内皮细胞软脑膜室管膜上皮：单层立方上皮，顶端连接紧密第35页,共72页，2024年2月25日，星期天36Theventriclesareacomplexseriesofspacesandtunnelsthroughthecenterofthebrain.Theventriclessecretecerebrospinalfluid,whichsuspendsthebrainintheskull.CSFisproducedbystructurecalledthechoroidplexusinlateral,thirdandfourthventriclesTheventriclesalsoprovidearouteforchemicalmessengersthatarewidelydistributedthroughthecentralnervoussystem.TheVentricularSystem&CSF第36页,共72页，2024年2月25日，星期天37TheVentricularsystemCSFflowsfromlateralventricle-3rdventriclethroughIVF3rdventricle&4thventricleareconnectedbyCerebralaqueductCSFflowsintoSubarachnoidspacethroughforamenofLuschka第37页,共72页，2024年2月25日，星期天38血脑脊液屏障第38页,共72页，2024年2月25日，星期天39血-脑脊液屏障的作用：1.维持脑脊液成分恒定。2.阻止血液中的有害 物质进入脑脊液内。3.特殊转运的酶系统，维持细胞内环境稳定。4.伸长细胞有主动运输物质的作用。第39页,共72页，2024年2月25日，星期天40室管膜细胞（伸长细胞）第40页,共72页，2024年2月25日，星期天413．脑脊液-脑屏障脑脊液-脑屏障（braincerebrospinalfluidbarrier）位于脑室和蛛网膜下隙的脑脊液与脑、脊髓的神经细胞之间，其结构基础为室管膜上皮、基膜和星型胶质细胞。

能阻止脑脊液中的有害物质进入脑脊髓实质。室管膜上皮间仅有缝隙连接和中间连接，一般无紧密连接。第41页,共72页，2024年2月25日，星期天42第42页,共72页，2024年2月25日，星期天43（二）血肿瘤屏障血肿瘤屏障（bloodtumorbarrier,BTB） 是存在于脑肿瘤细胞与脑毛细血管及神经组织之间的物质交换屏障。基本结构包括：毛细血管内皮基膜肿瘤细胞膜第43页,共72页，2024年2月25日，星期天44BBBBTBBTB第44页,共72页，2024年2月25日，星期天45在体血肿瘤屏障模型的建立第45页,共72页，2024年2月25日，星期天46脑肿瘤模型的评价第46页,共72页，2024年2月25日，星期天47血-瘤屏障通透性复杂多样脑肿瘤有时会出现复杂的血管变化： 血管密度增加、管径增大，血管内皮细胞数量增加、吞饮小泡增加、小泡运输功能亢进、毛细血管缺乏连续性等。第47页,共72页，2024年2月25日，星期天48血-瘤屏障存在异质性和个体差异

不同肿瘤的组织间液压

脑肿瘤内微血管结构、微血流动力学、血 管内及间质氧分压、间质pH

不同类型的肿瘤以及同一肿瘤的不同生长 阶段第48页,共72页，2024年2月25日，星期天49第二节物质通过血-脑屏障的方式和途径

脑的毛细血管长643.6km，其表面积达20平方米，毛细血管内每分钟扩散药物的距离可达40μm。物质透过血-脑屏障主要有四条途径：1.小分子直接经细胞间隙扩散2.脂溶性分子的融膜扩散3.特异受体介导的吞饮转运4.特异载体通道和酶系统第49页,共72页，2024年2月25日，星期天TransportmechanismsattheBBB.1=paracellulardiffusion,2=transcellulardiffusion,3=ionchannel4=ion-symportchannel5=ion-antiportchannel6=facilitateddiffusion,7=activeeffluxpump8=active-antiporttransport,9=receptormediatedendocytosis第50页,共72页，2024年2月25日，星期天51（一）被动扩散(Simplediffusion

)

一些物质以被动扩散方式通过血脑屏障。通透率：

物质分子量的大小

分子的极性

与血浆蛋白的结合程度第51页,共72页，2024年2月25日，星期天52（二）易化扩散(Facilitateddiffusion)

通过“镶嵌”在血脑屏障界面上的蛋白载体或离子通道来完成。易化扩散的特点：

顺浓度差：不需消耗能量

需要载体和酶系统参与

竞争性

专一性

饱和性第52页,共72页，2024年2月25日，星期天53（三）主动转运(Activetransport

)

细胞直接或间接利用代谢产生的能量将物质逆浓度梯度或电位梯度进行跨膜转运的过程，是物质通过血脑屏障的主要方式。载体种类：(1)氨基酸载体；(2)胺类载体；

(3)单羧酸载体；(4)腺苷载体；

(5)Na+-K+-ATP酶转运系统；(6)P-糖蛋白

(7)有机阴离子转运体(OAT)

主动转运的特点：

逆浓度差和逆电化学梯度：需要消耗能量

竞争性

专一性第53页,共72页，2024年2月25日，星期天Themostimportanteffluxtransporterswhichsofaridentifiedattheblood–brainbarrierbelongtotheclassofATPbinding-cassette(ABC)transportersPharmacolRev60:196–209,2008第54页,共72页，2024年2月25日，星期天P-GlycoproteinIHC-MidBrainCapillariesClinCancerRes16692007;13(6)March15,2007第55页,共72页，2024年2月25日，星期天P-GlycoproteinDoesmakeaDifference:Paclitaxel+Valspodar(ValspodarisapotentinhibitorofP-gp)PaclitaxelAloneEffectofvalspodarcoadministrationonthepaclitaxelbrainlevelsinnudemiceafterintravenousinjectionEffectofvalspodar/paclitaxelcoadministrationontheintracerebralgrowthofthehumanU118MGglioblastomainnudemice.第56页,共72页，2024年2月25日，星期天57（四）吞饮

也称为受体介导的转运(receptormediatedtransport,RMT)，是指大分子物质或物质的团块借助于细胞膜形成吞饮泡的方式进入细胞的过程。

蛋白质受体： 转铁蛋白质受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体等。第57页,共72页，2024年2月25日，星期天58第58页,共72页，2024年2月25日，星期天59（五）酶屏障

脑毛细血管内皮细胞上含有部分酶系统，可以使来自循环系统中的神经递质或药物降解转化，阻止其进入脑内发挥作用，维持脑内神经传递及内环境的稳定。含有的酶包括：单胺氧化酶γ-氨基丁酸转氨酶多巴氨脱羧酶假性胆碱酯酶第59页,共72页，2024年2月25日，星期天60（六）特殊部位转运脑室周围小器官(CVO)特点： 缺乏血脑屏障，血窦多，窦外无胶质突，仅有网状纤维包裹，毛细血管内皮有小孔，基膜不连续并与邻近胶质分开，有较大的通透性第60页,共72页，2024年2月25日，星期天61第61页,共72页，2024年2月25日，星期天62第三节治疗基因向脑及脑肿瘤内的递送

常用的治疗基因递送途径及方式：（一）直接递送1、直接定向接种（inoculation） 将治疗基因或病毒载体通过各种方式直接注入到活体靶组织内。 目前在动物和临床实验中使用最多的递送方式就是脑或脑肿瘤内局部注射。动物实验中最常见的：腺病毒、单纯疱疹病毒载体

第62页,共72页，2024年2月25日，星期天63直接定向接种优点：避开血-脑屏障和血-瘤屏障。直接定向接种缺点：接种的病毒扩散能力有限(1-2mm)操作较困难靶向性差

目前在临床脑肿瘤治疗上，结合手术直接给予化疗药物比较普遍。

第63页,共72页，2024年2月25日，星期天642．植入反转录病毒生产细胞（retro