培养基的配制与灭菌实验报告

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试验二培育基的配制和灭菌

一、试验目的

微生物的生长发育都有肯定的养分需要，培育基即人工培育微生物、为其生长发育供应所需养分的基质。培育基配好后必需经过灭菌方能用于分别培育微生物试验，因此培育基的配制和灭菌是植物病理试验室中最基本的工作，通过本次试验学习植病试验室中常用培育基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。

二、内容、材料和方法

(一)培育基的配制

培育基按组成成分及对这些成分了解的程度分为自然 培育基、半组合培育基和组合培育基三类，从物理性质上又分为液体培育基和固体培育基两类，培育基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次试验仅配制马铃薯琼脂培育基和牛肉膏蛋白胨培育基。1马铃薯蔗糖琼脂培育基（PSA）

这是植病试验室最常用的培育基(简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分别和培育，有时也用于植物病原细菌。

成分：马铃薯200克

蔗糖10~20克

琼脂17~20克

加水至1000毫升

方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。马铃薯蔗糖琼脂培育基略带酸性，培育真菌无需调整pH，培育细菌则调整pH至中性，此培育基留作下次试验分别培育病原真菌用，故不必调整pH。

5人分作一组，1、2组各作此培育基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥当保存，留待下次试验使用。

2肉汁胨培育基（BPA）

这种培育基主要用于细菌的分别和培育

成分：牛肉浸膏3克

蛋白胨5~10克

蔗糖10克

酵母浸膏1克

琼脂17~20克

加水至1000毫升

方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调整pH至7，趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。

牛肉浸膏和酵母浸膏非常粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开头沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。调整培育基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分别稀释配成1/20N的HCl和NaOH。取培育基2毫升，加蒸馏水7.5毫升，加指示剂溴百里酚蓝指示剂5滴，这时如培育基的测样呈黄色则用有刻度吸管加入1/20N的NaOH若呈蓝色则加入1/2ON的

HCl，使培育基最终呈草绿色即调整到中性，此刻所加酸或碱的毫升数的25倍即等于在1000毫升培育基中所需要加入lN的NaOH或HCl的毫升数(留意这次是作500毫升培育基)，加蒸馏水稀释的目的防止调整过程中培育基凝固。

调整pH至中性的简便方法是用石蕊示纸。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培育基和溴百里酚蓝或其它指示剂1—2滴，依据颜色反应，在所配的培育液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取样测定，如此反复多次，达到所需求的反应为止。

5人分为一组，3、4两组各作此培育基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约100毫升，灭菌后摆成斜面，其余300毫升分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥当存放，留待下次试验使用。

此外，1、2、3、4各组均制备15管试管装和2瓶三角瓶装的无菌水。

(二)培育基的灭菌

为了得到某种病原物的纯培育，配好的培育基必需经过灭菌才能使用，灭菌是指用物理或化学方法完全杀死器物表面及其内部的全部微生物，灭菌与消毒的概念不同，消毒则是指毁灭器物或植物组织表面的某些微生物(能常称杂菌)，而不是毁灭全部的微生物。

灭菌的方法许多，植病试验室常用的有干热灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法，一般培育皿、吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌。而培育基和试验用的土壤，则用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，详细灭菌方法和步骤如下：

1干热灭菌法

(1)将培育皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒)，包纸时应将吸取的一端放在取时先折开的一端，以便取用时手勿触及要求灭菌的一端。

(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有肯定的空隙以便流通空气。

(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。

(4)待箱内空气排出到肯定程度时，闭上排气孔，连续加热至肯定温度后，用定温固定温度，灭菌温度一般165℃—175℃保持1小时即可。

(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿，避开由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

2高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它的原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下：

(1)关好排水阀门放入清水至标度为止，留意水量肯定要加足，否则简单造成事故。

(2)将要灭菌的培育基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到肯定程度(不要太紧)，然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。

(3)通电加温，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，即活门冲出的全部是蒸气时则表示彻底，此时可关闭排气活门，假如过早关闭活门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。通常当压力表指针升至5磅时，打开排气活门放气，降至零点，再关闭活门。

(4)压力表的指针上升时，锅内温度也渐渐上升，当压力表指针升至15磅时，蒸气温度相当于120℃—121℃(等于一个大气压)，此时开头计算灭菌时间，掌握热源，使处于15磅压力保持30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。

(5)略微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓慢排解，然后渐渐开大活门，气压缓缓下降，留意勿使排气过快，否则会使锅内的培育基沸腾而冲脱或沾湿棉花塞，但排气太慢又使培育基在锅内，受高温处理时间过长，这样对培育基也是不利的。一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。

(6)当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，打开锅盖取出培育基，如需制备固体斜面培育基时，则应趁热将试管斜放在桌上，上面盖上报纸以免落灰尘，冷却后便可收起。(7)最终将高压灭菌器内的剩余水排出。

(8)抽取上述灭菌的培育基，放入25℃温箱中，48小时后不见杂菌生出，便证明培育基已达到灭菌目的，可以使用。

此外，有些培育基在经高压灭菌后，其养分成分简单分解而失去使用价值，此时可采纳间歇蒸气灭菌法，即将培育基放入高压灭菌器内，加热至100℃，保持1小时，每天灭菌一次，连续进行三次，即可达到灭菌的目的，又不至使养分物质分解。

三、思索题

1培育基有哪几种类别?各有什么特点和用途?

2干热灭菌和高压蒸汽法适用范围如何?电热烘箱和高压锅如何操作?各有哪些使用留意事项?

3怎样检查培育基灭菌是否彻底?关于微生物试验--培育基的配制和灭菌的思索题！急！2022-5-819:32提问者：喜爱和爱123|扫瞄次数：1520次1.在一般状况下为什么试管或三角瓶培育基要用棉花塞而不用软木塞或橡皮塞？2.高压蒸汽灭菌过程中为什么肯定要排放锅内的冷空气？我来帮他解答2022-5-819:58满足回答1.棉花起到过滤、透气的作用啊！并且棉花的开头大小是可以尽可能转变的，而不需要非得找到合适的软木或橡皮塞！2.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，连续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸