T∕CACM 013-2016 金银花快速 PCR 鉴定

ICS：11.120.99C10/29团体标准T/CACM0132016金银花快速PCR鉴定QuicklyPCRidentificationofLoniceraeJaponicaeFlos2016-12-12发布2016-12-12实施中华中医药学会发布前言 2规范性引用文件 3术语和定义 5仪器设备 6试剂和溶液配制 7检验程序 8结果判定 9结果报告 本标准的全部技术内容为推荐性。本标准是对《中华人民共和国药典》标准的补充。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位:中国中医科学院中药资源中心、国药种业有限公司。本标准主要起草人:袁媛、黄璐琦、蒋超、赵玉洋、周骏辉、何雅莉、王继永。请注意本标准的某些内容有可能涉及专利,本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。1金银花快速PCR鉴定本标准规定了使用快速PCR鉴定金银花药材和饮片、种子种苗的通用方法和要求。本标准适用于金银花药材和饮片、种子种苗鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。《中华人民共和国药典》GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》GB/T23632《进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程》GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。按一定规则取自某一整体的一个或多个部分,并能反映该整体的相关信息,可以作为判断该整体的基础。从样品中提取出DNA的方法。通过一定技术使一段特定的DNA片段拷贝数增加的过程,可通过聚合酶链式反应扩增技术实现。聚合酶链式反应polymerasech模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段拷贝数呈几何倍数增长。其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行检测。一般使用对照样品代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过程可获得目标核酸片段的操作。使用常见伪品药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。2以水代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸污染。对照样品包括对照药材和种子种苗对照样品。种子种苗对照样品是由中药材种子种苗标准起草单位提交,经全国中药材种子(种苗)标准化技术委员会认定并保存,与品种名称相符的种子种苗样品。金银花快速PCR鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照样品比较的验证方式,即依据金银花特异性DNA位点差异,使用单核苷酸多态性标记法进行鉴定。利用碱裂解法提取金银花模板DNA,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。5仪器设备所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。使用前应进行温度校准。6试剂和溶液配制除另有规定外,实验试剂为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂;实验用水符合GB/T6682的要求;所配制的试剂均应灭菌后保存,并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效日期和配制者姓名;PCR试剂应小量分装保存以减少污染;材料及试剂的保存都应有防污染措施。溶解12郾1g三羟甲基氨基甲烷(Tri溶解12郾1g三羟甲基氨基甲烷(Tri1L,分装后高压灭菌。3保存。EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(在),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(80mL去),aqDNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(离),聚)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(子),合)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(水),酶)时置冰上操作。2EDTA·2H2O,加入醋酸,充分混匀,加去离子水定容至1L,室温保存,使用时用去离子水50倍稀释。在80mL去离子水中溶解溴酚蓝250mg、二甲苯青250mg、蔗糖250mg,加水定容至100mL,分装。7检验程序为防止交叉污染,收样、取样、粉碎、DNA提取、核酸扩增与产物检测应在不同操作间或在同一操作间不同隔离区域进行,进入各区域应严格按照单一方向进行,即样品制备区寅核酸制备区寅扩增区寅检测区。送检样品应可分成2批,每批可分为同样的3份,总量不低于100g。收样时应检查包装的完整性,并在样品袋上贴上标签,填写采集数据表。对商品包装和送样说明进行拍照记录,照片随样品一起备档。送检样品抽样方法参照2015年版《中华人民共和国药典》四部药材和饮片取样法(通则0211)进行取样。去除药材和饮片表面附着物,依次使用75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。送验样品、试样的抽取、分取应有代表性。在生产基地取样,送验样品可以为组织或器官;在加工或销售地点取样,送验样品为种子或种苗。取送检样品置乳钵、匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨粉碎,必要时加适量液氮研磨。800滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min800滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min或静置5min;转移500滋L上清液至一新的作为DNA模板待测或-20益保存备用。每个送检样品必须重复2次作为DNA模板待测或-20益保存备用。每个送检样品必须重复2次,每1次从送检样品提取核酸的过程都必须设置1个提取空白对照。注:使用碱裂解法提取的金银花DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜长期保存。首次使用本方法时,应校对PCR仪温控准确性,并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的Taq聚合酶的适用性。4PCR检测应重复2次,并设置阳性对照、阴性对照和空白对照。EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(滋L、),双蒸)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(鉴),水)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(定引),19郾1)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(物),滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(各),混)延伸10s,35个循环。对扩增产物进行检测或置4益下保存。长下检测荧光,若PCR产物出现与阳性对照相同的荧光即为阳性结果,反之为阴性结果。取PCR扩增产物,加入6伊上样缓冲液混匀,2%琼脂糖凝胶电泳染色,紫外波长下检测。阴性对照和空白对照无条带,且送检样品与阳性对照在100~200bp有一条DNA条带为阳性结果,否则为阴性结果。8结果判定在阴性对照、阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下,若送检样品与阳性对照一致,则判定测试结果为阳性,否则为阴性。9结果报告样品经检测后,实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录,出具检测报告。检测报告至少包含以下内容:送检样品的名称、状态和明确的标识;检测依据;取样方法与日期;储存条件;检测开始和结束日期;检测负责人和实验人员;阳性对照、阴性对照、送检样品;特定方法取得的结果,结果使用的单位及计算方法;检测结论;检测过程观察到的特别情况;其他需要报告的内容。检测结果应来自同一实验室样品的两份送检样品。当一份送检样品的结果为阳性,另一份为阴性时,要重新测试。可以适当增加核酸扩增反应体系中DNA模板量,使两份样品得到相同结果。每个样品应至少制备两份DNA,必要时需检测模板DNA的质量,确保提取的DNA片段大于扩增片段。核酸扩增可设置PCR抑制剂对照。如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测,检测结果不一致,5可在检测报告中注明检测低限,检测低限应符合最低含量水平。11废弃物处理检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理,有毒有害废弃物应经过除害再进行处理,处理要符合环保要求。6附录A(资料性附录)金银花快速PCR鉴定体系的建立为绿原酸、木犀草苷等酚酸、黄酮类物质,临床应用非常广泛。为绿原酸、木犀草苷等酚酸、黄酮类物质,临床应用非常广泛。尽管在2005年版《中国药典》中已明确将忍冬作为金银花唯一植物来源,但之前各版《中国药花习用品,金银花民间药用非常混乱。《中国植物志》收载有102种忍冬属植物,其中作为“金银花冶中药材商品民间用药的约有19种(含变种)。民间作为“金银花冶商品用药的忍冬属植物除金银忍冬,盘叶忍冬、硬毛忍冬外均属于忍冬组缠绕亚组,形态学非常类似《中国药典》(2015年版)药材鉴定项下收载了金银花性状鉴定和薄层色谱鉴定方法。但破碎的中药性状鉴定特征会模糊化甚至消失,导致鉴定效力减弱;而通过薄层色谱对供试品中绿原酸进行鉴定存在一定缺陷,主要表现为:淤绿原酸在多种植物中均存在,作为专属性鉴定成分值得商榷;于该方法无法鉴定金银花及其近缘种。与传统中药鉴定方法相比,中药分子鉴定具有准确性高、重现性好等特点,且不受样品形态的限制,原药材、饮片、粉末乃至含有生药原型的中成药(丸剂、散剂等),以及中药材种子种苗和种质资源均可应用,由于其所需检样量少,对珍稀药材及化石标本的鉴定更具应用价值。建立金银花快速PCR鉴定标准,有利于满足中药材和中药饮片、种子种苗真伪鉴定的需求,保证中药质量可控。本附录收集了9种金银花常见伪品用于设计特异性PCR引物,具体样品信息见样品表。金银花trnL-trnF序列625位G/T变异可以准确鉴定金银花及其同属伪品,据此位点设计快速EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(J),J)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(Y),Y)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(H),H)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(郾),郾)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(F),R)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(:),:)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(5),5)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(AGTCCCTCTATC),TGGATGAGAAA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),C)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(-),GA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(3),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(;),T)7图A.1金银花正伪品序列比对及引物设计结果A.3实验样品选取来自不同产地的8个正品金银花(忍冬)及忍冬属9种16个近缘种伪品材料进行快速PCR研究。植物样品采自广西、河南、山东、北京、安徽地区,凭证标本保存于中国中医科学院中药资源A.1丹毒风热毒蕴证可选用的中成药序号物种拉丁名产地个数鉴定人1忍冬河南省封丘县4刘红彦2忍冬山东省临沂市4李圣波3红腺忍冬广西崇左市2吴庆华4华南忍冬山东省临沂市1李圣波5灰毡毛忍冬广西南宁市2吴庆华6黄褐毛忍冬广西桂林市2余丽莹7水忍冬广西桂林市2余丽莹8金银忍冬安徽省合肥市1彭华胜9郁香忍冬北京市2郝近大新疆忍冬北京市2郝近大繁果忍冬北京市2郝近大8PCR反应程序PCR反应程序:94益预变性1min;94益变性10s,60益退火延伸10s,35个循环,获得扩增产物。取出PCR管,对反应产物进行检测或置4益下保存。束后,将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。上述PCR各主要参数均经过系统的考察。束后,将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。上述PCR各主要参数均经过系统的考察。取20mg干燥材料,使用碱裂解法提取总DNA,所提取DEQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(淆品),DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(均),可)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(获),以)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(得),满)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(淆品),DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(均),可)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(获),以)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(得),满)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(约),足)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(1050),PCR)bEQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(p大小的扩),反应的要求)产物,与trnL-trnF片段大小一致(图A郾M:DL2000marker;1:忍冬;2:红腺忍冬;3:灰毡毛忍冬;4:华南忍冬;5:黄褐毛忍冬;6:水忍冬;7:金银忍冬;8:郁香忍冬;9:新疆忍冬利用金银花(忍冬)SNP鉴定引物JYH郾F和JYH郾R进行位点特异性PCR反应,并分别考察:型PCR仪(Eppendorf公司)、TC-512型PCR仪(TECHNE公司)对PCR反应稳定性的影响。对金银花鉴定结果进行考察,结果表明,使用快速PCR鉴定引物扩增时,如当退火温度为66益时,伪品也有荧光;当退火温度为70益和72益时,均无荧光;当退火温度为68益时,仅正品有荧减少PCR反应时间,在退火温度为68益时减少PCR反应时间,在退火温度为68益时,逐渐减少循环数。当循环数为27个循环,PCR产物出条带,故最终选择循环数为30。出现弱荧光(图A郾3B)。然而,当选用27个循环时,变性-出条带,故最终选择循环数为30。92362℃23264℃3A30cyle23435cyle23440cyle1234B95℃123491℃1234185℃23487℃23485℃123483℃23410S2345S2343S2341S234HSTaq234ApataTa4234TransTa4234rTa234EPCT-100234ABI9700234TC-51