蛋白质组分析课件

第十三讲

蛋白质组数据分析

1本章内容9.1二维凝胶电泳数据分析9.2蛋白质质谱数据分析9.3蛋白质互作生物信息学9.4分析细胞通路的生物信息学方法234Whyproteomics？5Proteomics1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。“...theanalysisofcompletecomplementofproteins.

Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction."(StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience,291,1221(2001))整体性、动态性和系统性6Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.7

从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域aeukaryoticCell蛋白质组学(proteomics)891011Biology/Disease-drivenHPP

12蛋白质组学研究范畴蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定蛋白质结构分析蛋白质--蛋白质生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库13蛋白质组学应用举例研究细胞结果功能和分子组成发现新的药物靶位点发现新型生物学活性的分子和药物差异蛋白质组学发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物修饰蛋白质组学遗传或药理学扰动的分子解剖病理生理学研究中药机理相互作用蛋白质组学研究药物作用方式和毒性机理植物抗虫抗旱抗逆遗传育种和分子育种资源环境海洋生物141516寻找差异蛋白质环孢素A处理前环孢素A处理后正常组织肿瘤组织细胞组织171819Initialgoalwastorapidlyidentifyalltheproteinsexpressedbyacellortissue–agoalthathasyettobeachievedforanyspecies!20蛋白质组学比基因组学研究复杂蛋白质数量大于基因数蛋白质是动态的蛋白质序列复杂，不能PCR扩增，不能自动化测序21GenomicDNAmRNABiologicalsystemFunctionalproteinProteinproductstechnologyemergingprototypematuresequencingExpressionprofileStructuraldeterminationProteinlinkagemap(catalog)QuantitativeproteinprofileProteinlinkagemap(dynamic)SubcellularlocationPosttranslationalModificationanalysisActivityprofileSystemsimulationDataintegrationcurrentstatus

ofproteomictechnologies22Basictechnologiesof

Proteomics2-Delectrophoresisofcomplexproteinmixtures：ThecoretechnologyofproteomicsIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethods（生物质谱：ESI-MS,MALDI-TOF-MS）酵母双杂交Bioinformatics232425生物信息学在蛋白质组学中的应用26生物信息学在蛋白质组学中的应用272829

1二维凝胶电泳数据分析30

小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.Görg,TechnicalUniversityMunich,Germany31

样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS电泳（SDSelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）双向电泳实验流程

32细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量差异分析双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染考染荧光蛋白标记样品制备分离染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程33样品制备细胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除核酸、脂类34差异分析图像获取图谱分析银染考染荧光蛋白标记染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞Separation双向电泳第一向第二向细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程3536双向电泳：传统方法sample胶在SDS缓冲液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直胶管中进行等电聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝胶电泳非连续梯度胶按等电点分离（电荷）按分子量分离（质量）37等电聚焦电泳原理38固相凝胶(支持膜上0.5mm厚凝胶)丙烯酰胺缓冲液:Immobiline®

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度39平衡过程40412-DE/MS蛋白质组学经典工作流程差异分析图像获取图谱分析蛋白标记图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向银染考染荧光染色42ProteinDetectionMethods43Coomassie™Blue-考马斯亮蓝染色灵敏度，低至0.01mg(“胶体”考染)非特异性染色染料与蛋白成比例结合线性化好扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度纯度不够有限的动力学范围44

胶体考马斯亮蓝染色1mgE.colistrainBIPGphor24cmpH4-7ColloidalCBBG250staining45银染灵敏度，低至0.2ng在凝胶基质中与蛋白交联自动催化反应染凝胶表面蛋白线性化程度比考染低一些大分子物质也被染色步骤多，某些步骤时间控制严格46SilverstainedgelofE.coliLysate

IPG4-7SilverstainedwithPlusOne™KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.47差异分析蛋白标记挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染考染荧光染色图谱分析2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程48凝胶的图像处理分析扫描，图像处理斑点检测和定量数据分析2-DE数据库建立ImageScannerIII图像扫描系统492-DE/MS蛋白质组学经典工作流程差异分析蛋白标记蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染考染荧光染色挖胶图谱分析5051自动斑点切取——Spotpicker切点针头胶盘522-DE的局限性53SWISS一2DPAGE数据库是由日内瓦大学附属医院临床化学中心实验室与瑞士生物信息协会合作创办的人类维凝胶蛋白数据库为在2D凝胶上预测蛋白质迁移提供了许多标化的凝胶图象和工具比较已知细胞类型或组织的凝胶和SWISS一2DPAGE的图象即可以帮助识别关键标志物5455SWISS-2DPAGEstatistics

56MasterCreationLastmodifiedDetectedspotsIdentifiedspotsNo.ofEntriesARABIDOPSISDec-00May-0311117957DICTYSLUGSep-97Sep-9731642516ECOLI3.5-10Aug-95Jan-9823642061804-5Jun-99Dec-0044970334.5-5.5Oct-98Dec-00102597655-6Oct-99Mar-041536106815.5-6.7Dec-00Dec-0060516166-9Dec-00Dec-001100226-11Dec-00Dec-0012373431DIGE4.5-6.5May-03Mar-04858174153MOUSEISLETSSep-98May-0325286344BATDec-00Dec-0022428537WATSep-98Oct-01354013676LIVERSep-98Apr-002836200107NUCLEILIVERApr-00May-034000158MUSCLESep-98May-03265013671STAPHYLOCOCCUSMar-04Mar-04596250198YEASTFeb-95Mar-0419401016257HUMANCECJan-98Mar-0430775640CSFAug-93Mar-04166430930DLD1Jan-99Mar-04344010867ELCAug-93Mar-0421443519HEPG2Aug-93Mar-0428629845HEPG2SPAug-93Mar-04173415525HL60Sep-97Mar-0431642617KIDNEYSep-97Mar-0428964428LIVERAug-93Mar-04241313868NUCLEILIVERApr-00Mar-0414972714LYMPHOCYTEMar-04Mar-049267762LYMPHOMAAug-93Mar-0418906033NUCLEOLIHELA2-DPAGENov-01Mar-0412715144NUCLEOLIHELASDSNov-01Mar-0411598189PLASMAAug-93Mar-04196662670PLATELETAug-93Mar-0421934118RBCAug-93Mar-04180019033U937Aug-93Mar-048954232585960人类肝脏61？？？？？？626364652生物质谱技术66

数据及供电系统┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓进样系统离子源质量分析器检测接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系统

质谱仪包含了五个主要的系统：1、进样系统(sampleintroduction)2、离子源系统(ionizationsource)3、质量分析仪(massanalyzer)4、离子探测器(detector)5、数据处理系统(datasystem)

质谱仪的基本结构67离子源电离：：

质谱进行分析时，首先要做的就是离子化，也就是将待测物处理过后产生气相的离子，并带有电荷。离子源:

使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同,分为硬电离和软电离。68对离子源的贡献—软电离方式目前有两种做法能使得蛋白质转变为气态离子而不会改变其结构与形态。由JohnB.Fenn所发展的方法是运用一个很强的电场将样品喷洒出去(ESI)，而产生一个个带电荷并能自由飞翔的离子。运用一个强烈的激光脉冲，在适当的条件下(视能量，与样品的结构和化学环境而定)运作，样品可接受激光脉冲的能量而被释放成为自由的离子(MALDI)，由KoichiTanaka最先提出的技术。69诺贝尔奖的提示70ESI电离机制RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets试样离子准分子离子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他离子71电喷雾电离产生多电荷离子72多电荷离子的有关计算对于蛋白质，产生的多电荷离子为：[M+nH]n+，系列离子假设某一质谱峰(m/z)1对应的离子为[M+nH]n+,另一相邻质谱峰(m/z)2对应的离子为[M+(n+1)H](n+1)+,且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:解方程组得到M和n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。73肌红蛋白电喷雾质谱图带10~30个电荷的系列分子离子74基质辅助激光解吸电离技术

(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization，MALDI)试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。75关于基质：极性化合物溶解样品芳环吸收激光易结晶均匀分散样品分子

MALDI常用基质基质性状适用波长应用烟酸固体266nm,2.94

m,10.6

m蛋白质2,5-二羟基苯甲酸固体266nm,2.94

m,10.6

m蛋白质芥子酸固体266nm,337nm,355nm,2.94

m蛋白质-氰基-4-羟基肉桂酸固体337nm,355nm蛋白质3-羟基吡啶甲酸固体337nm,355nm核酸、配糖体2-(4-羟基苯偶氮)苯甲酸固体266nm,337nm蛋白质、配糖体琥珀酸固体2.94

m,10.6

m蛋白质、核酸间硝基苄醇液体266nm蛋白质甘油液体2.94

m,10.6

m蛋白质邻硝苯基辛基醚液体266nm,337nm,355nm合成高分子76质量分析器Massanalysis质量分析器是质谱仪的核心,它将离子源产生的离子按其质荷比(m/z)的不同﹑在空间的位置﹑时间的先后或轨道的稳定与否进行分离,以便得到按m/z大小顺序排列而成的质谱图。77两组四极杆分别加上+(u+Vcont)和–(u+Vcont)，其中u直流电压部分，Vcont为射频电压部分=2f,f为频率。四极杆质量分析器(QuadrupoleMassAnalyser)在场的中心和两条对角线上的任何一点电位为零。通过直流和射频电压的改变来控制不同荷质比的离子通过；可以允许单一荷质比的离子通过；也可以进行荷质比扫描78massscanningmodem1m3m4m2m3m1m4m2singlemasstransmissionmodem2m2m2m2m3m1m4m2四级杆模式79飞行时间质量分析器(TimeOfFlightMassAnalyser,TOF)离子源中的离子经加速电压获得的速度为：其中

ze为电荷，V为加速电压，m为质量。飞行管长度L，到达检测器的时间为：质量越大，飞行时间越长，实现分离。m1和m2两个离子：用已知样品进行校正，得到未知离子的质量。80质谱鉴定蛋白的一般方法ArtificialspectrabuiltArtificiallytrypsinatedDatabaseofsequences(i.e.SwissProt)SpotremovedfromgelFragmentedusingtrypsinSpectrumoffragmentsgeneratedMATCHLibrary基于肽质量指纹谱（PMF）81现行的PMF软件工具名称网址特点第一类PepSeaPeptIdent/MultIdenthttp://www.ch/tools/peptident.html根据谱图中m/z值与数据库中给定误差范围内m/z值相匹配的数目给出得分第二类MOWSEMS-Fithttp://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgibn/mowse使用的得分算法考虑到蛋白质大小和肽片段长度对匹配几率的影响第三类ProFoundMascothttp://prowlrockefeller.edu/cgi-bin/ProFound使用基于概率的得分，提供得分的统计基础，估计某些匹配可能反映随机事件而不是真实特性的概率82以相关的质谱实验数据从序列数据库中进行发掘的蛋白质MSFit83质谱数据输入框翻译后修饰种类的选择可选的质谱仪酶选择可选的物种可选的序列数据库84MOWSEscore:MOlecularWeightSearch,ScoringbasedonpeptidefrequencydistributionfromtheOWLnonredundantDatabase%cov:totalaacoverage%tic:fragmentscoverage85863蛋白质相互作用分析

（protein–proteininteractions，PPIs)

Itisbeyondanydoubtthatproteinsandtheirinteractionsplayanessentialroleinmostcomplexbiologicalprocesses.分析蛋白质间的相互作用及方式,认识与特定生理活动相关的蛋白质网络,绘制蛋白质相互作用图谱Schizophrenia-associatedproteins

87typesofprotein–proteininteractions(PPIs)

Homo-oligomersvs.hetero-oligomersStableinteractionsvs.transientinteractionsCovalentvs.non-covalentObligatevsnon-obligateproteincomplexFuzzyproteincomplexesPPIsinterfacesexhibitbothshapeandelectrostaticcomplementarity883.1研究PPIs的实验方法yeasttwo-hybridsystemsaffinitypurification/massspectrometry89建立的基础：真核细胞的转录因子：

DNA结合域：DNAbindingdomain,BD

转录激活域：Activationdomain,AD当两者独立存在时,无转录激活功能,但两者只要相互接近,即可激活转录3.1.1酵母双杂交技术

yeasttwo-hybridsystem90酵母双杂交系统的组成与BD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)与AD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称靶蛋白(prey或target)带报告基因(reportgene)的宿主细胞baittargettargetbait9192酵母双杂交技术的应用筛选、鉴定蛋白质间的相互作用：验证预测的蛋白间相互作用、鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响、筛选蛋白的级联底物。筛选、鉴定小分子与蛋白质之间的相互作用：鉴定干扰相互作用的分子、筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响。93酵母双杂交技术的应用94酵母双杂交技术的特点优点：不需要抗体胞内实验缺点：筛选工作需要构建基因文库对于不能进入核内的蛋白质(如分泌蛋白、膜蛋白)和存在比较复杂的翻译后修饰作用的高等生物蛋白质,该技术尚不适用假阳性结果比例较高95双报告基因963.1.2Affinitypurificationcoupledtomassspectrometry97Co-IP:Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWesternblot鉴定PAGE质谱鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，结合位点分析；筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档983.2PPIspredictionEffortstoexperimentallydeterminetheinteractomeofnumerousspeciesareongoing,andanumberofcomputationalmethodsforinteractionpredictionhavebeendevelopedinrecentyears.

993.2.1Textmining-basedPPIspredictiontext-miningbasedcomputationalmethodologies,aimingtoextractinformationforproteinsandtheirinteractionsfrompublicrepositoriessuchasliteratureandvariousbiologicaldatabases.100Left:SumofGoogle-Scholarcitationsforthetext-miningtools.Right:Google-Scholarcitationtrendsforeachtextminingtoolindividually.101

3.2.2ThemethodofphylogeneticprofilesbasedpredictionThismethodisbasedonthehypothesisthatpotentiallyinteractingproteinsshouldco-evolveandshouldhaveorthologsincloselyrelatedspecies.Asimilarmethodcanbeappliedtoproteindomains,whereprofilesareconstructedfordomainstodetermineiftherearedomaininteractions.

102一个基因组中不同的蛋白质编码基因，在另外一个基因组中，却融合成了一个基因，这表明基因融合或分裂事件的发生。从功能的角度看，基因的融合可能导致它们具有相关的生物学功能，例如它们可能在同一个蛋白质复合物（complex）、通路（pathway）或过程（process）中发挥功能。这种方法还可以预测可能存在的蛋白质-蛋白质相互作用3.2.3ThedomainfusionorRosettaStonemethodforPPIsprediction1033.2.4InferenceofinteractionsfromhomologousstructuresChenXW,LiuM(2005)Predictionofprotein–proteininteractionsusingrandomdecisionforestframework.Bioinformatics21:4394–4400.AloyP.,andR.B.Russell.(2003)"InterPreTS:proteinInteractionPredictionthroughTertiaryStructure".Bioinformatics,19(1),161-162.Fukuhara,Naoshi,andTakeshiKawabata.(2008)"HOMCOS:aservertopredictinteractingproteinpairsandinteractingsitesbyhomologymodelingofcomplexstructures"NucleicAcidsResearch,36(S2):185-.KittichotiratW,MGuerquin,REBumgarner,andRSamudrala(2009)"ProtinfoPPC:awebserverforatomiclevelpredictionofproteincomplexes"NucleicAcidsResearch,37(WebServerissue):519-25.ShoemakerBA,ZhangD,ThanguduRR,TyagiM,FongJH,Marchler-BauerA,BryantSH,MadejT,PanchenkoAR(2010)InferredBiomolecularInteractionServer--awebservertoanalyzeandpredictproteininteractingpartnersandbindingsites.NucleicAcidsRes.2010Jan;38(Databaseissue):D518-24.url:/pubmed/19843613EsmaielbeikiR,NebelJ-C(2014)Scoringdockingconformationsusingpredictedproteininterfaces.BMCBioinformatics,15:171.104Inferenceofinteractionsfromhomologousstructuresemployingasequencebasedmethod(e.g.Interolog)tosearchforproteincomplexstructuresthatarehomologoustothequerysequencesTheseknowncomplexstructuresarethenusedastemplatestostructurallymodeltheinteractionbetweenquerysequencestheadvantage：inferringproteininteractions;suggestsmodelsofinteractstructurallyBut,limitednumberofknownproteincomplexstructures105InterologbasedpredictionAninterologisaconservedinteractionbetweenapairofproteinswhichhaveinteractinghomologsinanotherorganism.

SupposethatAandBaretwodifferentinteractinghumanproteins,andA'andB'aretwodifferentinteractingdogproteins.ThentheinteractionbetweenAandBisaninterologoftheinteractionbetweenA'andB'ifthefollowingconditionsallhold:A

isahomologof

A'BisahomologofB'A

andBinteractA'

andB'interact106InterologbasedpredictionInterPreTS:proteinInteractionPredictionthroughTertiaryStructureDBID:homologuesinadatabaseofinteractingdomains107InterologbasedpredictionHOMCOS(HomologyModel