2013-5-柠檬酸循环-1课件

Chapter23柠檬酸循环CitricAcidCycle(TricarboxylicAcidCycle)TCASelectedtopicsinthehistoryofbiochemistry:personalrecollections,IX.

作者：GiorgioSemenza,AnthonyJohnTurner

（Krebs循环）早期发现:

柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸等能迅速被肝、肾切片氧化上述二羧酸能增加鸽胸肌悬液摄取氧，其程度远较本身氧化时所需氧为多？

它们对鸽胸肌的氧化营养物起着催化作用。

柠檬酸可经异柠檬酸转变为α-酮戊二酸

α-酮戊二酸可转变为琥珀酸丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制物，导致琥珀酸不能脱氢氧化成为延胡索酸。在加有丙二酸的肌肉匀浆中加入柠檬酸，可引起琥珀酸的堆积。

Krebs发现草酰乙酸加入肌肉组织，可迅速与来自丙酮酸或加入的乙酸合成柠檬酸，

三羧酸循环的学说。Born25August1900)

Hildesheim,GermanyDied22November1981(aged

81)

Oxford,England

CitizenshipUnitedKingdomNationalityGermanyFieldsInternalmedicine,biochemistryInstitutionsKaiserWilhelmInstituteforBiology

UniversityofHamburg

CambridgeUniversity

UniversityofSheffield

UniversityofOxfordKnown

fordiscoveryoftheureacycleandthecitricacidcycleNotableawardsNobelPrizeinPhysiologyorMedicine(1953)Dr.HansKrebs一.柠檬酸循环的准备过程二.柠檬酸循环反应机制三.柠檬酸循环的调控四.柠檬酸循环的生物学意义因为在循环的一系列反应中,关键的化合物是柠檬酸,所以称为柠檬酸循环,又因为它有三个羧基,所以亦称为三羧酸循环,简称TCA循环。由于它是由H.A.Krebs（德国）正式提出的，所以又称Krebs循环。C6H12O6+6O26CO2+6H2O+30/32ATP柠檬酸循环：在有氧的情况下，葡萄糖酵解产生的丙酮酸跨越线粒体膜时氧化脱羧形成乙酰CoA，在线粒体基质中乙酰CoA经一系列氧化、脱羧、水合及脱氢等，最终生成CO2和还原型递氢体，后者进入氧化呼吸链生成H2O并产生能量的过程.葡萄糖有氧氧化总反应：葡萄糖酵解丙酮酸氧化脱羧柠檬酸循环TAC循环

G（Gn）丙酮酸乙酰CoA

CO23NADH+H+1FADH2H2O

[O]ATPADP胞液

线粒体

糖的有氧氧化代谢途径（三阶段）线粒体膜氧化呼吸链GTP（ATP）C3C2C6C5C4CO2CO2…..NADH+H+NADH+H+

FADH2C架变化与递氢NADH跨线粒体膜CO2丙酮酸进入线粒体反应概况ATP进入循环2次脱羧1次直接产能（2种递氢体）4次脱氢４CNADH+H+一.柠檬酸循环的准备过程

——丙酮酸脱羧形成乙酰CoA1.1生物转化总反应式1.2丙酮酸脱氢酶复合体1.3反应机制1.4丙酮酸脱氢酶的调控NAD+NADH+H+

丙酮酸乙酰CoA+CoA-SH辅酶A+CO2丙酮酸脱氢酶系1.1生物转化总反应式丙酮酸+CoA-SH+NAD+乙酰CoA+CO2+

NADH+H+

丙酮酸脱氢酶系酶辅因子功能丙酮酸脱氢酶（E1）TPP,Mg2+

丙酮酸氧化脱羧二氢硫辛酰转乙酰基酶（E2）硫辛酰胺辅酶A转乙酰基至CoA激酶、磷酸酶二氢硫辛酸脱氢酶（E3）FADNAD+

使二氢硫辛酰胺再氧化丙酮酸脱氢多酶复合体：是催化功能上有联系的几种酶通过非共价键连接彼此嵌合形成的复合体。其中每一个酶都有其特定的催化功能，且具有其催化活性必需的辅酶。1.2丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)组成与功能CryoEMimages.ZhouZHetal.PNAS2001;98:14802-14807©2001byTheNationalAcademyofSciences1.2.1丙酮酸脱氢酶复合体立体结构模型E2:硫辛酰转乙酰基酶

E3:二氢硫辛酸脱氢酶E1:丙酮酸脱氢酶不同多聚体的三种酶镶嵌构成多酶复合体。丙酮酸脱氢酶

E1:8个三聚体硫辛酰转乙酰基酶

E2:8个三聚体二氢硫辛酸脱氢酶

E3:6个二聚体不同多亚基蛋白的三种酶镶嵌构成多酶复合体1.2.2TPP辅酶C-OHC-O`OC-H3形成活性负碳离子，结合丙酮酸TPP催化脱羧的机制E1-TPP-羟乙基E2中硫辛酰赖氨酰长链结构氧化态还原态乙酰基结合态Lys残基硫辛酸E2中Lys残基通过酰胺键连接硫辛酸硫辛酸分子含2个SH，有氧-还变化硫辛酸分子中的SH起酰基转运作用1.2.3硫辛酰胺辅酶1.2.4辅酶FAD（复习）丙酮酸+CoA-SH+NAD+乙酰CoA+CO2+NADH+H+

1.3丙酮酸氧化脱羧反应机制/chemistry_d/templates/student_resources/shared_resources/animations/pdc/pdc.html总化学反应方程：反应的动态过程与分子机制：图解见后一页△G0’=-39.5kJ/mol1.

-羟乙基-TPP的生成2A.羟乙基脱氢、与硫辛酰胺结合

3.乙酰CoA的生成2B.乙酰基传递4.硫辛酰胺的还原

5.NADH+H+的生成砷化物对E2辅基硫辛酰胺的毒害作用E2-O-As(p96)-（R-As）亚砷酸盐和有机砷化物破坏硫辛酸：破坏SH的还原性而致酶失活。（与砷酸对糖酵解阻断比较？）

1.4丙酮酸脱氢酶复合体的调控①NADH、乙酰CoA产物竞争性抑制（别构调节）②磷酸化和去磷酸化的共价修饰调控（主要调节E1）抑制剂激活剂E1E2上的激酶E2上的磷酸酶、Ca2+E2乙酰CoACoAE3NADHNAD+E1

E1+

活性上升活性下降

P共价修饰（Covalentmodification）是酶中的氨基酸残基与某种化学基团发生可逆的共价结合而使酶发生活性变化的过程，这是酶的一种活性可逆的调节机制。酶辅因子功能丙酮酸脱氢酶（E1）TPP,Mg2+

丙酮酸氧化脱羧二氢硫辛酰转乙酰基酶（E2）硫辛酰胺辅酶A转乙酰基至CoA激酶、磷酸酶二氢硫辛酸脱氢酶（E3）FADNAD+

使二氢硫辛酰胺再氧化丙酮酸脱氢多酶复合体：是催化功能上有联系的几种酶通过非共价键连接彼此嵌合形成的复合体。其中每一个酶都有其特定的催化功能，且具有其催化活性必需的辅酶。1.2丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)组成与功能2.1反应机制2.2反应的质能结算2.3反应调控2.4生理意义乙酰CoA进入TAC彻底氧化（线粒体）二.柠檬酸循环TCA概貌⑴乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸柠檬酸合酶草酰乙酸CH3CO～SCoA乙酰辅酶A柠檬酸HSCoA关键限速酶H2O2.1柠檬酸循环各步反应乙酰CoA

+草酰乙酸

柠檬酸+CoA-SH△G0’=-32.2kJ/mol柠檬酸合酶是同二聚体酶，其二级结构几乎全部为α-螺旋。各亚基具有大小两个结构域，游离时呈开放状态，以结合草酰乙酸，结合后，小结构域发生18度旋转，封闭结合部位，同时暴露乙酰CoA结合位点，与之结合催化缩合反应进行。/wiki/index.php/The_Citric_Acid_Cycle/lehninger5e/content/cat_010/1609_citrate_synthase.html?v=chapter&i=16010.01&s=16000&n=00010&o=%7C00610%7C00580%7C00590%7C00510%7C00540%7C00600%7C00550%7C00570%7C00630%7C00010%7C00020%7C00030%7C00040%7C00070%7C00080%7C00090%7C00100%7C01000%7C02000%7C03000%7C04000%7C05000%7C06000%7C07000%7C08000%7C09000%7C1000克莱森酯缩和反应KeyAAHis320His274Asp375具有严格的底物专一性和立体选择性，可调控。抑制剂:ATP,NADH,琥珀酰CoA，酯酰CoA

氟乙酰CoA——氟柠檬酸（致死性合成）不可逆结合顺-乌头酸酶，抑制TCA。丙酮酰CoA——乙酰CoA类似物

柠檬酸合酶的调节异柠檬酸⑵柠檬酸异构化生成异柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸酶H2OHOHCOOHCOOHCH2CCOOHCHHOHCOOHCOOHCH2CCOOHCH平衡状态下浓度比：90:4:6柠檬酸异柠檬酸铁原子硫原子是铁-硫蛋白，催化可逆反应（脱水与水合）形成的中间产物顺-乌头酸与酶的脱离缓慢

顺-乌头酸酶CO2NAD+异柠檬酸⑶异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸α-酮戊二酸草酰琥珀酸NADH+H+异柠檬酸脱氢酶关键酶ΔG0’=-20.92kJ/mol异柠檬酸脱氢酶酶活性:(+)ADP,NAD+；(-)ATP,NADH反应方程ΔG0’=-20.92kJ/molα-酮戊二酸异柠檬酸TCA中第一次氧化还原(脱羧脱氢)反应异柠檬酸+NAD+α-酮戊二酸+CO2+NADH+H+酶活中心结合NAD+或NADP+及Mg2+或Ca2+。金属离子对酶活是必需的。参与底物结合与催化的AA残基：Asp275、279、252，Lys212，Tyr140，Ser278、95，Asn97和Thr78；下面还有Arg101、110、133三个残基抓住异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶氧化脱羧脱氢反应

E－Tyr：E-Tyr吸引C2－羟基H；C2－H传到NAD＋E-Lys吸引

C相邻羧基H；金属离子络合稳定富电O；C－C键破裂脱羧，C双建接受Tyr上的H，回复羰基异柠檬酸在植物或微生物中，还可以有另一条转化途径，即当能量贮备充足时，由异柠檬酸裂解酶催化，裂解产生琥珀酸和乙醛酸（乙醛酸循环）。异柠檬酸脱氢酶活性的调节变构激活剂：ADP，异柠檬酸，NAD+，Mg++，变构抑制剂：ATP,NADH+H+,低能核状态时，酶活加强，三羧酸循环增强。细菌中的异柠檬酸脱氢酶，还可以通过Ser残基的磷酸化（共价修饰）而大大降低酶活性，去磷酸化后活性升高。CO2⑷α-酮戊二酸氧化脱羧

生成琥珀酰辅酶A

α-酮戊二酸脱氢酶系HSCoANAD+NADH+H+琥珀酰CoAα-酮戊二酸α-酮戊二酸+CoA-SH+NAD+

琥珀酰CoA

+CO2+NADH+H+

OCOOHCH2CH2COOHC关键酶ΔG0’=-33.47kJ/mol第二次脱羧脱氢反应机制与调节TCA中第二次脱羧脱氢,形成高能化合物并释放大量能量α-酮戊二酸脱氢酶复合体:组成\催化机制和调控均类似于丙酮酸脱氢酶系,酶1催化α-酮戊二酸脱羧，并转运产生的4C琥珀酰基发生后续反应.抑制剂：琥珀酰CoA，NADH，ATP与丙酮酸脱氢酶系不同之处是酶无共价修饰调节。丙酮酸进入线粒体后产生几个高能中间代谢产物？酶催化反应机制⑸琥珀酰CoA转变为琥珀酸（底物水平磷酸化）琥珀酰CoA合成酶琥珀酰CoAATPADP琥珀酸GDP+PiGTPHSCoA琥珀酰CoA

+

GDP

+Pi

琥珀酸+GTP

+CoA-SH

(TCA唯一一次直接产能)ΔG0’=-30.12kJ/mol⑹琥珀酸氧化脱氢生成延胡索酸TCA循环延胡索酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2琥珀酸

+FAD

延胡索酸+

FADH2琥珀酸3rd氧化还原反应ΔG0’=-3.35kJ/mol琥珀酸脱氢酶TCA途径中唯一嵌入线粒体内膜的酶与氧化磷酸化从结构上关联(参与两条代谢途径）

Fe-S蛋白质（将在生物氧化章中详述）高度立体专一性FAD为辅酶,与酶蛋白共价连接丙二酸（强抑制剂）⑺延胡索酸水化生成苹果酸延胡索酸苹果酸延胡索酸酶H2O延胡索酸+H2O

苹果酸⑻苹果酸脱氢生成草酰乙酸

苹果酸脱氢酶

草酰乙酸NAD+NADH+H+苹果酸+

NAD+草酰乙酸+NADH+H+

苹果酸第4次氧化还原反应P草酰乙酸CH2CO～SoA(乙酰辅酶A)苹果酸琥珀酸琥珀酰CoAα-酮戊二酸异柠檬酸柠檬酸CO22HCO22HGTP延胡索酸2H2HNAD+NAD+FADNAD+三羧酸循环总图2.2TCA循环结算：

加入一分子乙酰CoA

A.两次脱羧--2分子CO2

B.四次氧化还原转移4对H

(3NADH2+1FADH2)

C.产生1分子GTP(ATP)

D.自由能变化(P108)

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TCA运转一周的净结果是氧化1分子乙酰CoA，草酰乙酸仅起载体作用，反应前后无改变。TCA中的一些