动物细胞表达制备药用蛋白

关于动物细胞表达制备药用蛋白思考要制备出我们想要的蛋白，需要了解些什么，做些什么？第2页,共25页，2024年2月25日，星期天

生产用动物细胞的要求和获得常用生产用动物细胞的特性基因工程细胞构建和筛选第3页,共25页，2024年2月25日，星期天

生产用动物细胞的要求和获得（1）原代细胞是直接取自动物组织器官,经过消化分离而获得。用量大，浪费时间。常用的有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。NO.1第4页,共25页，2024年2月25日，星期天（2）二倍体细胞系原代细胞经过传代筛选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点：①染色体组型是2n核型；②贴壁依赖接触抑制；③可传代培养50代；④无致瘤性。第5页,共25页，2024年2月25日，星期天（3）转化细胞系常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。自发人工诱变第6页,共25页，2024年2月25日，星期天常用生产用动物细胞的特性

W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,

倍增时间为24h，有限寿命50代。安全，用于制备疫苗。NO.2第7页,共25页，2024年2月25日，星期天MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。核型为2n=46。属成纤维细胞。有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。第8页,共25页，2024年2月25日，星期天BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。第9页,共25页，2024年2月25日，星期天Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。第10页,共25页，2024年2月25日，星期天基因工程细胞构建和筛选NO.3真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类：1）病毒载体牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒2）质粒载体第11页,共25页，2024年2月25日，星期天

1）病毒载体牛痘病毒：用构建多价疫苗腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。

杆状病毒：用于外源基因表达。第12页,共25页，2024年2月25日，星期天2）质粒载体在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分：①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。②含有使基因表达的调控元件。③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。第13页,共25页，2024年2月25日，星期天基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选第14页,共25页，2024年2月25日，星期天1）基因载体的导入基因载体导入动物细胞最常用方法是：

磷酸钙沉淀法电穿孔法

第15页,共25页，2024年2月25日，星期天磷酸钙沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。第16页,共25页，2024年2月25日，星期天电穿孔法：

借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。第17页,共25页，2024年2月25日，星期天真核生物细胞生产药用蛋白优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构,理化特性最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO（注射用重组人促红素

）细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。因此，可以针对性的筛选细胞株第18页,共25页，2024年2月25日，星期天

由于CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤(methotrexate,MTX)所抑制,用含有目的基因及与之相连的DHFR基因的重组质粒转化CHOdhfr细胞,利用浓度不断提高的MTX选择抗MTX的细胞系,其中DHFR基因及与之相连的目的基因一起扩增,从而使目的基因高水平表达。主要采用DHFR系统和GS系统

2）高效表达工程细胞株的筛选二氢叶酸还原酶系统DHFR第19页,共25页，2024年2月25日，星期天第20页,共25页，2024年2月25日，星期天DHFR扩增仅仅发生在二个等位基因中的一个。在稳定系中扩增的基因得以保持，因为它们位于染色体上DHFR基因座上（均匀染色区），而其等位基仍保持正常的单拷贝。而在不稳定系中当选择压力消除时，扩增的基因至少会部分丢失，但未丢失的是以染色体外的方式（双微体）存在。第21页,共25页，2024年2月25日，星期天每个双微体带有2-4DHFR基因，双微体可以复制，但它们没有着丝粒，结果它们不能附着在有丝分裂的纺锤丝上，因此不能均等分离进入子细胞，是染色体外的微小染色体。第22页,共25页，2024年2月25日，星期天谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量时,利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺,在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下,加入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亚砜(methioninesulphoximine,MSX),可使GS基因及与之相连的目的基因扩增,达到提高目的基因表达水平的目的。由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。主要哺乳细胞株为NS0细胞及CHOK1