基因诊断课件

17四月2024基因诊断1978年，美国科学院院士美籍华裔科学家YWKan(简悦威

)和Dozy应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰状细胞贫血症的基因诊断，标志着检验诊断进入基因诊断时代。2

分子诊断的概念和特点分子诊断的基本技术分子诊断的医学应用3一、基因诊断的概念和特点(一)定义一、分子诊断的概念和特点

利用现代分子生物学和分子遗传学的技术，对生物体的DNA、RNA、蛋白质及代谢分子进行定性或定量分析，从而对疾病作出诊断的方法。称为分子诊断。分子诊断的分类：DNA诊断----检测相关基因的结构及其表达功能是否正常。RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表达的分析。蛋白质诊断----对编码蛋白质的质和量表达的分析。代谢物诊断----对生化代谢产物等小分子物质的分析。基因诊断（二）特点（二）特点1．遗传性疾病2．感染性疾病3．肿瘤4．法医学的应用5．组织病理学特异性强灵敏度高应用性广早期诊断(三)基因诊断方法和传统疾病诊断方法的区别表型诊断(传统方法)基因诊断诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常分类临床诊断血清学诊断生化学诊断DNA诊断RNA诊断特异性表型改变在很多情况下是非特异性的，往往难以明确诊断，延误病情以探测基因为目标，只要有特异性探针，利用分子杂交原理即可诊断，具有很高的特异性敏感性探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可早期诊断因为表型改变往往出现较晚，难以早期诊断在表型改变之前，基因结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断(三)基因诊断方法和传统疾病诊断方法的区别核酸分子杂交技术

核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用二、分子诊断常用技术杂交信号检测分子杂交样本抽提DNARNAcDNA反转录合成寡核苷酸引物制备和标记探针PCR扩增分子诊断的基本技术流程分子诊断的基本技术流程（一）、核酸分子杂交原理：核酸的变性复性理论。双链的核酸分子在某些理化因素（如高温等）作用下，双链解开，待条件恢复时，又按碱基互补配对规律形成双链结构。在这一过程中，不同来源的DNA（RNA）分子，只要具有部分互补配对的碱基序列，即可形成杂合双链。复性

*核酸分子杂交的分类：1.杂交发生的环境：固相杂交：样品位于固相支持物上，与液相中的探针杂交液相杂交：样品和探针在液相中杂交。2.杂交样品的位置：核酸印迹杂交：SouthernBlot,NorthernBlot斑点杂交（dotblotting）或狭缝杂交原位杂交（insituhybridization）基因芯片（一）核酸印迹杂交一般步骤:

1.探针的制备（标记）2.样品的制备3.电泳分离4.转膜5.杂交：预杂交——杂交6.结果检测探针的制备（标记）探针（probe）——用放射性核素或其他标记物标记的短的核酸片段（几十至几百核苷酸），它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样品中的特定DNA或RNA。种类：DNA,RNA,寡核苷酸标记物：放射性核素（同位素）：32P，3H，35S生物素，地高辛，荧光素[如异硫氰酸荧光素(FITC)等]

制备方法:（1）化学法：标记物分子活性基团与核酸分子上的基团发生化学反应；（2）酶促法：标记核苷酸（原料中的一种dNTP），酶促合成探针。

酶促法最为常见:不同种类的探针:（1）DNA探针标记：T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶等（2）RNA探针标记：相应基因克隆入载体，体外转录过程中被标记。（3）cDNA探针标记：反转录过程中被标记。不同标记范围：（1）末端标记：如T4多核苷酸激酶对探针进行5’末端标记;（2）整链标记：切口平移法，随机引物法等样品的制备：组织中提取：基因组DNA用特定的限制性内切酶消化细胞总RNA基因文库核酸混合物3.电泳分离：待测样品按照分子量大小分离，分子量markerDNA、RNA:琼脂糖凝胶电泳RNA、蛋白质等:聚丙烯酰胺凝胶电泳4.转膜印迹（印渍）技术：将存在于凝胶中的生物大分子转移到固定化介质上并加以分析的技术。用于DNA、RNA、蛋白质的检测。硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜、PVDF膜等(1)DNA印迹技术：SouthernBlotting(2)RNA印迹技术：NorthernBlotting,主要用于检测组织细胞中特定基因的表达（mRNA的存在）(3)蛋白质印迹技术：WesternBlotting毛细管转移法，电转移法等5.杂交预杂交：封闭样品中非特异性的结合位点。鲑精DNA，脱脂奶粉等杂交：将探针溶于杂交缓冲液，膜浸于其中进行杂交洗膜：缓冲液洗涤去除未杂交的探针。6.结果检测同位素：放射自显影荧光、化学发光：压X光片生物素等：酶标亲和素——底物显色(ABC法)地高辛：酶标抗体——底物显色(AP等)Southernblot用于基因组基因的定性定量、基因突变和特定条件下获得的基因片段（酶切片段等）的分析。

注意事项：DNA样品的酶切,大片段脱嘌呤降解,电泳胶的处理(变性液),膜上DNA的固定(干烤或紫外交联)

Northernblot用于特定基因表达的定性定量分析注意事项：（1）去除RNA酶。玻璃器皿：烘烤、氯仿冲洗、DEPC水浸泡；溶液：DEPC水处理；（2）制备凝胶：含有甲醛等变性剂。MOPS+甲醛。（3）样品的处理（变性）：甲酰胺或甲醛（4）RNA电泳：18S和28SrRNA作为参照（5）RNA的转移：NaOH浸泡和DEPC水冲洗去除甲醛。OverexpressionofsisandmycmRNAinCO8.TwomicrogramsofpolyA+(sisprobe)and20µgoftotalRNA(mycandcdk4probes)fromeachcelllinewereanalyzedbynorthernblotting.三种印迹技术的比较NorthernblotWesternblotSouthernblot（二）斑点杂交（dotblotting）与狭缝杂交用于特定基因表达的定性定量分析

将RNA或DNA变性后直接点样于膜上，再采用特定的探针进行杂交。Fig.2.NorthernblotanddotblotanalysesofSPRR3innormalepithelia(N)andmatchedtumourtissues(T).Ethidiumbromide-stainedtotalRNAandß-actinhybridizationareshownasloadingcontrolforthenorthernblotanddotblot,respectively.Figure1.DifferentialexpressionofBREmRNAinvarioushumantissuesusingthedot-blottinghybridizationassay.BREexpressionwasanalyzedinadot-blotmembranefilterfromClontechusinglabeledBRE-cDNAprobeasdescribedinMaterialsandMethods.(A)ThenamesandpositionsofthetissuemRNAspottedonthemembrane.(B)Hybridizationresults.（三）原位杂交（insituhybridization）

：

菌落原位杂交：菌落从琼脂板复印到NC膜，裂解菌落，核酸固定，杂交。用于基因克隆和基因文库的筛选

真核细胞核酸原位杂交：细胞，组织切片确定特定核酸序列在染色体上的定位；组织细胞中特定基因的表达水平（即相应mRNA的水平）Fig.1.Recentadvancesininsituhybridization(ISH)forthepast15yearsa:DetectionofribosomalRNAgene(rDNA)locuswithradioactiveribosomalRNA.

b:DetectionofrDNAbyanon-RIlabelingmethod.

c:DetectionofrDNAlociinIndicaricebyFISH.

d:Detectionofmulti-colorfluorescencefromdifferentprobes(telomere,greenandTrsA,red)simultaneously.等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法（allele-specificoligonucleotidehybridization,ASOH）如果基因的某一位点发生了突变，那么根据已知基因突变位点的核苷酸序列，设计并合成两种寡核苷酸探针，一种与突变基因的碱基序列互补（M），另一种与正常基因在相应位点上的核苷酸序列互补（N），通过杂交即可确定待检的2个等位基因是否有一个或全部发生了突变。核酸分子杂交技术

核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用二、分子诊断常用技术（二）、PCR——聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）按照DNA半保留复制的原理，在体外进行连续反应，呈几何倍数扩增特定DNA分子的过程。

DNA模板合成原料：dNTP引物：一对高温DNA聚合酶：Taq酶缓冲液：含Mg2+H2O补充体积1.反应体系：2.反应过程：20-35个循环，每个循环包括：变性：95℃10-45s退火：55-65℃10-30s延伸:72℃30-60s循环之外：预变性：95℃3—5min;继续延伸72℃7min;回到室温。3’5‘5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’5’5’5’3’3’3’3’5’3’2n3’5‘5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’PCR的衍生类型：1.反转录PCR2.原位PCR3.重组PCR4.不对称PCR5.多重PCR6.反向PCR7.锚定PCR8.巢式PCRPCRPCR3.PCR引物设计：（1）长度：16—40bp,尤以18—24bp为最佳（2）末端：5’末端可与模板不互补，3’末端必须互补，3’末端最好不为A（3）序列：GC含量40%—75%，Tm值在56—62℃为最佳特异性避免引物二级结构4.PCR促进剂：甘油（10—15%）、DMSO（5%）、甲酰胺（5%）等。*反转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）:用于克隆已知基因或检测基因表达情况。培养表达目的基因的细胞，或分离表达目的基因的组织；提取细胞总RNA;反转录成cDNA;以cDNA为模板，设计引物进行PCR：（1）上游引物:5’—ttgaattc

atgacaccacctgaacgtctcttc—3’（2）下游引物:5’—ttggatcc

ctacagagcgaaggctccaaagaa—3’琼脂糖凝胶电泳观察目的基因条带；胶回收，酶切，克隆入载体。TNF-βmRNA:(618nucleotides)atgacaccacctgaacgtctcttcctcccaagggtgtgtggcaccaccctacacctcctccttctggggctgctgctggttctgctgcctggggcccaggggctccctggtgttggcctcacaccttcagctgcccagactgcccgtcagcaccccaagatgcatcttgcccacagcaccctcaaacctgctgctcacctcattggagaccccagcaagcagaactcactgctctggagagcaaacacggaccgtgccttcctccaggatggtttctccttgagcaacaattctctcctggtccccaccagtggcatctacttcgtctactcccaggtggtcttctctgggaaagcctactctcccaaggccacctcctccccactctacctggcccatgaggtccagctcttctcctcccagtaccccttccatgtgcctctcctcagctcccagaagatggtgtatccagggctgcaggaaccctggctgcactcgatgtaccacggggctgcgttccagctcacccagggagaccagctatccacccacacagatggcatcccccacctagtcctcagccctagtactgtcttctttggagccttcgctctgtag

2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp121234核酸分子杂交技术

核酸扩增技术

DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用二、分子诊断常用技术（三）DNA序列测定核酸分子杂交技术

核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用二、分子诊断常用技术（四）单核苷酸多态性检测技术1SNP概念2SNP特点3SNP检测技术4实验SNP的概念单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。它包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式SNP在基因组内的形式:一是遍布于基因组的大量单碱基变异;二是分布在基因编码区(codingregion),称其为cSNP，属功能性突变。

SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：（1）非转录序列要多于转录序列（2）在转录区非同义突变的频率,比其他方式突变的频率低得多。SNP的特点在遗传学分析中,SNP作为一类遗传标记得以广泛应用,主要源于这几个特点:（1）密度高SNP在人类基因组的平均密度估计为1\1000bp,在整个基因组的分布达3×106个,遗传距离为2～3cM,密度比微卫星标记更高,可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。（2）富有代表性某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。SNP的特点（3）遗传稳定性与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP具有更高的遗传稳定性。（4）易实现分析的自动化SNP标记在人群中只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个“+\-”或“全\无”的方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。一、SNPs经典检测方法一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如:1.限制性片段长度多态性法PCR-RFLP;2.单链构象多态性法PCR-SSCP;3.变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);4.等位基因特异性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等PCR-RFLP方法原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。PCR-RFLP原理图单链构象多态性(SSCP)原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。变性梯度凝胶电泳（DGGE）原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。电泳开始时,DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关,而一旦DNA泳动到某一点时,即到达该DNA变性浓度位置时,使得DNA双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时,DNA片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异,使得其变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条带。等位基因特异PCR(AS-PCR)原理：根据SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。

SNPs高通量的检测方法另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通量、自动化程度较高的检测SNPs的方法,较为常用的有:1.DNA测序法;2.DNA芯片检测;3.变性高效液相色谱(DHPLC)法;4.飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测等等变性高效液相色谱(DHPLC)原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。66MALDI-TOF原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。MassARRAYSNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术相结合，实现基因分型检测。基于MassARRAY®分子量阵列平台的iPLEXGOLD技术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。MassARRAY技术原理:

先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在

SNP

位点上，延伸

1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。

MassARRAY技术原理:MassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。MassARRAY技术流程：

应用：

1.

确定基因多态性和疾病的关系

2.

解释个体间的表型差异对疾病的易感程度

3.

对未来疾病做出诊断

4.

研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开发及临床合理用药

5.

个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进行法医鉴定及个体识别

优势（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；（2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；（3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔；（4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器；（5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；（6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说的4重反应；（7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。（8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。核酸分子杂交技术

核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术

蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用二、分子诊断常用技术（五）、基因芯片

(genechip,genemicroarray)生物芯片

DNA芯片、蛋白质芯片、组织芯片基因芯片技术(一种高通量的固相核酸杂交技术)将大量预先合成的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信息（基因序列和表达信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，故名基因芯片。818283848586878889Cy3标记病变细胞cDNACy5标记正常细胞cDNA两图叠加分析（红色）（绿色）应用基因芯片筛选差异表达基因90核酸分子杂交技术

核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用二、分子诊断常用技术（六）什么是蛋白质组？主要方法蛋白质分离技术

凝胶双向电泳、HPLC；蛋白质鉴定技术

Edman测序、质谱技术；图像分析与生物信息图像分析软件，数据库；相互作用研究技术

酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。94核酸分子杂交技术

核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用二、分子诊断常用技术遗传病肿瘤感染性疾病产前诊断器官移植配型法医学三、分子诊断的医学应用96遗传病检测待检者细胞内是否存在可能导致遗传性疾病的基因突变或缺失（表现为基因单个或多个核苷酸位点的突变，或大片段核苷酸的丢失）。检测对象为一般患者或胎儿（产前诊断）

国外遗传病检测的项目常染色体显性遗传病诊断性遗传检测基因

软骨发育不全症FGFR3Marfan综合征FBN1Charcot-Marie-Tooth神经病各PMP22,EGR2,MPZ,NEFL,MTMR2先天性心脏病(LQTS),各型KCNQ1,KCNH2,SCN5A,KCNE1,KCNE2,ANK神经纤维瘤(1型,2型)NF1,NF2多囊肾(1型,2型)PKD1,PKD2结节性硬化(1型,2型)TSC1,TSC2遗传性高胆固醇血症LDLRAchondroplasia常染色体隐性遗传病诊断性遗传检测基因囊性纤维化症CFTR先天性神经性耳聋(SNHL),GJB2,GJB3,SLC26A4先天性心脏病(LQTS)KCNQ1,KCNE1地中海贫血症,B型HBB(血红蛋白B链)白化症OCA1苯丙酮尿症 PAH脊柱肌萎缩症SMN1肝豆状核变性(Wilson)病ATP7B多囊肾PKHD1,PKHDL1

先天性代谢病X-连锁隐性遗传病诊断性遗传检测基因杜兴肌营养不良症DMDRett综合征MECP2血友病(A型,B型)F8,F9白化症OA1G-6-PD缺乏症G6PDX-连锁显性遗传病遗传性肾病(Alportsyndrome)COL4A5Y-连锁遗传病性反转病SRYSOX9无精症或少精症DAZ

线粒体(母系遗传)疾病诊断性遗传检测基因线粒体疾病线粒体基因组(如tRNAlys,tRNAleu基因等)甲基化异常疾病(基因功能变化)诊断性遗传检测基因Angelman综合征15q11-13印记基因/甲基化异常/UBE3APrader-Willi综合征15q11-13印记基因/甲基化异常/SNRPNBeckwith-Wiedemann综合征11p15印记基因/甲基化异常/LIT1,H19

三联核苷酸重复体疾病(动态变化)诊断性遗传检测基因亨廷顿(CAG)nX-脆性综合征(CGC)n6-54Normal54-200Premutation>200Affected复杂性疾病的分子诊断复杂疾病相关的易感基因糖尿病,1型 GAD2糖尿病,2型 AKT1,APCS,APM1,CRP,GCK,KCNJ10,PBX1,RAGE,SORBS1糖尿病(MODY) TCF1,TCF14肥胖症/早发型 MC4R,SORBS1高血压 BMPR2,HUT2哮喘 ADRB2,IL4充血性心衰 GNA11,GNAQ,GNAS,RAB3A,RAB4,RAB5C,RAD冠心病 LIPC,LPL,PAI-1帕金森病 ABCB1阿尔滋海默病

BACE,CAST,NCSTN,OLR1,PS1,CHAT精神分裂症 DDC,DGSC,DGS1,DISC1,DISC2,DRD3,GRN1,GRN2A,GRN2B,

GRN2C,GRN2D,GRM5,KCNN3,NTF3,NTS,NTSR1两相情感性精神病

ABCG1,CUX2,DDCLeber病患者是遗传性视神经病(线粒体DNA第11778位基因突变)5

3

3

5

G正常人PCR变性杂交电泳Leber病患者PCR/SSCP分析Leber病患者PCR/SSCP分析5

3

3

5

AG→A正常人纯合突变杂合突变+1.15kb0.20kb×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5

3

正常基因5

3

突变基因T→A1.35kbOxaN1镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析酶切电泳放射性探针杂交图谱多态性

-地中海贫血HomoHeteroNormal5.2kb4.6kb

-珠蛋白基因3

末端缺失0.6kbβ-地中海贫血5

3

BgIIIBgIII5.2kb5

3

BgIIIBgIII4.6kb遗传病肿瘤感染性疾病产前诊断器官移植配型法医学三、分子诊断的医学应用109用基因诊断技术检测肿瘤肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略.一.通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤:染色体易位及基因融合是较普遍的现象.如:淋巴瘤和淋巴结反应性增生.它是由于T细胞受体(TCR)基因和IgH基因重排,使原来相隔数百个碱基的IgH和TCR基因的V区和J区靠近在一起.用PCR扩增该区域片段,通过长度分析就能判断是否发生了基因重排.

二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤

癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变1.癌基因-ras与肿瘤:ras是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变,高发区是第12、13和61位密码子.如90%的胰腺癌,50%的结直肠癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突变.ras癌基因点突变检测方法:

a.PCR-ASO法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类型。

b.PCR-SSCP法：根据PCR扩增的目标DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该