山羊胚胎生产及冷冻保存技术规范

1山羊胚胎生产及冷冻保存技术规范本文件规定了山羊胚胎生产及冷冻保存的技术要求。本文件适用山羊胚胎生产及冷冻保存。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1571羊胚胎移植技术规程NY/T1674牛羊胚胎质量检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1超数排卵Superovulation利用外源性促性腺激素诱发雌性动物卵巢多个卵泡发育，并排出多个具有受精能力的卵子的方法。3.2体外受精Invitrofertilization哺乳动物的精子和卵子在人工控制的体外环境中完成受精过程。3.3玻璃化冷冻Vitrification利用含有高浓度的渗透性抗冻保护剂溶液处理胚胎，然后将胚胎装入冷冻载体并直接投入液氮快速降温，使液体形成玻璃态，可有效减少冷冻过程中有害冰晶的形成，使胚胎所受物理性伤害大大降低的一种胚胎冷冻方法。3.4慢速冷冻Slow-freezing利用含有低浓度的渗透性抗冻保护剂溶液处理胚胎，然后将胚胎装入冷冻载体并按照一定程序于程序冷冻仪中植冰和降温，最后置于液氮中保存的一种冷冻方法。3.5体外受精胚invitro-fertilizedembryo通过体外受精获得的胚胎。4胚胎生产4.1超数排卵胚生产4.1.1药品与器械孕酮阴道栓（CIDR）、氯前列烯醇（PGF2α)、促卵泡素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）（或促黄体素（LH），或促排3号）、青霉素、链霉素、复合麻醉剂、PBS液（附录A1）、冲配液（附录A2）、胚胎操作液（附录A3）、生理盐水、75%酒精、碘酊；手术台、植栓枪、羊用冲胚管、滞留针（18G）、手术剪、手术刀、止血钳、缝针（圆针、三棱针）、外科手术缝线、注射器、连续变倍实体显微镜、恒温台、检胚皿、培养皿。4.1.2供体母羊选择2所选用供体母羊必须符合品种要求或标准（有国标或地标的品种，参照品种标准），连续三代内系谱清楚、健康无病，发育到性成熟后，繁殖机能正常的个体。4.1.3饲养管理保持饲养环境温度稳定、适宜、卫生，避免应激；制定合理的供体羊饲粮配方，保证蛋白质、能量、维生素和微量元素等营养平衡，保持中等膘情；供给清洁饮水，适当运动。4.1.4超数排卵用植栓枪将CIDR（含孕酮300～500mg）放入供体母羊阴道内，放置CIDR之日为0d，第9d第二次补栓，第15d起早晚间隔12h肌肉注射FSH，注射总量100～200IU（或10～15mg），每天按照总量的5:3:2递减连续注射3d，第16d上午注射完FSH后立即撤CIDR，同时注射氯前列烯醇2mL。4.1.5发情鉴定与诱导排卵注射完FSH后，观察母羊发情情况。对有发情征兆的母羊，采用公羊试情，以供体母羊愿意接受试情公羊爬跨，判断为发情。做好发情时间记录，同时静脉注射hCG500～800IU，或肌注LH50~100IU，或肌注促排3号10～20μg。4.1.6配种可采用自然交配或人工授精进行发情母羊的配种。自然交配配种2次，人工授精输精3次。发情时立即配种1次，每间隔12h再配第2或第3次。人工授精，可使用鲜精或冻精，鲜精活力≥0.7以上，冻精解冻后活力≥0.3，每次输精有效精子数3×107个，输精容积0.5mL～1mL。4.1.7手术冲胚采用羊胚胎移植技术规程（NY/T1571-2007）中5.1部分。4.2体外受精胚生产4.2.1药品和器械超数排卵药品、消毒药品、外科手术器械和常用器械见4.4.1。肝素、卵母细胞体外成熟培养液、体外受精液、早期胚胎体外培养液；CO2培养箱、CO2钢瓶、超净工作台。4.2.2卵母细胞收集4.2.1.1活体取卵按照4.1.2选择供体母羊，按照4.1.4对供体母羊进行超数排卵处理。在第6次注射FSH前12h禁食，最后1次FSH注射12h，参见羊胚胎移植技术规程（NY/T1571-2007）中5.1中外科手术方法暴露卵巢，用生理盐水浸润的纱布包裹卵巢，用预吸有抽卵液（附录A4），用带12号针头的5mL注射器抽吸卵巢上所有直径3～6mm的有腔卵泡中的卵丘卵母细胞复合体（COCs）和卵泡液，抽吸完后将抽吸物盛在60mm的培养皿中。4.2.1.2屠宰场收集卵巢选择符合品种要求、系谱清楚的淘汰母羊，屠宰后收集卵巢，放入含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的生理盐水或PBS液的保温瓶中，2h～4h送回实验室，然后参见4.2.1.1.中的方法抽吸卵母细胞。4.2.3卵母细胞体外成熟用卵母细胞成熟培养液（附录A5）于35mm培养皿中制作60μl-80μl微滴，覆盖矿物油将，在CO2培养箱中平衡至少2h。将收集的COCs用卵母细胞成熟培养液洗涤2次后移入微滴，每个微滴放15枚～20枚COCs，然后转入38.5℃、100%湿度和5%的CO2的培养箱中培养24h，经透明质酸酶处理脱去卵丘细胞，于体视显微镜下观察，排出第一极体者为成熟卵母细胞。34.2.4精液收集与准备在体外受精前30min收集新鲜精液或冷冻精液，精液来源公畜系谱清楚，且精子活力必须达到4.1.6中的要求。将精子洗涤液（附录A6）与精液按照1:1的比例缓慢加入精液，混匀后1000rpm×5min离心洗涤2次，然后将精子的密度用精子获能与体外受精液（附录A7）调至4×106个/mL～6×106个/mL。4.2.5获能与体外受精将20个～30个成熟的卵母细胞移入用50μl精子获能与体外受精液（附录A7）制成的受精液滴中，然后加入2μl调节好密度的精液到每个液滴，在38.5℃、100%湿度和5%的CO2的条件下精卵孵育18h～22h。4.2.6早期胚胎培养将与精子孵育后的卵子（假定的受精卵）在SOF液中洗涤2次后，移入预先在培养箱内预先平衡了2h的早期胚胎培养液（A8）制成的滴内。将20枚～25枚受精卵分别移入100μl的发育培养液，在38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养4～8d至桑椹胚或囊胚阶段。5胚胎质量检测按照NY/T1674-2008的规定执行。6胚胎冷冻保存将质量检测为A级的胚胎进行冷冻保存,低于A级的作为鲜胚进行移植。6.1慢速降温冷冻保存6.1.1药品与器械0.5mol/L的蔗糖溶液（附录A9）、1.6mol/L的乙二醇冷冻保存液（慢速冷冻保存液附录A10）；细管、细管塞、检胚针、装管器、液氮罐、程控降温仪，以及4.4.1中胚胎观察器械。6.1.2装管将胚胎移入慢速冷冻保存液制成的液滴中，平衡10min后，用0.25mL细管采用三段或五段装管法（附录B）装管，胚胎装在中间段的冷冻保存液中，两边的液体是0.5mol/L的蔗糖溶液。6.1.3冷冻将装有胚胎的细管从室温（20℃)经10min降温到0℃,经过15min降到-8℃,然后平衡10min，经过45min从-8℃缓慢降温到-30℃,然后平衡10min，最后从-30℃经10min降温到-35℃,平衡5min后直接投入液氮中保存。6.2玻璃化冷冻保存6.2.1药品与器械0.5mol/L的蔗糖溶液（附录A9）、10%乙二醇PBS液（附录11）、EFS30冷冻保存液（附录12），细管、细管塞、检胚针、装管器、液氮罐、程控降温仪，以及4.4.1中胚胎观察器械。6.2.2细管玻璃化冷冻将胚胎移入10%乙二醇冷冻液平衡5min，然后移入EFS30冷冻保存液中平衡1min后，迅速按照附录B2示意图装管、封口后，迅速直接投入液氮中。6.3包装要求将冷冻胚胎装塑料指形管，在塑料指形管上标记供体母畜号、数量、与配公畜号（或冻精号）及生产日期。47解冻7.1慢速冷冻保存胚胎的解冻将冷冻胚胎细管在空气中停留10s，放入35℃水浴锅解冻10s，拔去细管塞在解冻后1min～5min内完成移植。7.2玻璃化冷冻解冻将细管从液氮罐取出，在空气中停留5s，放入30℃水浴锅中直至蔗糖溶液段由白色变为无色时取出细管用力一甩，使细管中液体充分混合，然后拔去细管塞，将胚胎在1min～5min内完成移植。5（资料性附录）各种液体配制A1PBS液（磷酸盐缓冲液）8mg/mLNaCl,0.20mg/mLKCl,1.14mg/mLNa2HPO4,0.2mg/mLKH2PO4，配制好后0.22μm滤膜过滤4℃保存。A2冲胚液0.1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+0.025mg/mL卡拉霉素的PBS溶液，配制好后0.22μm滤膜过滤4℃保存。临用时维持在35～37℃。A3胚胎操作液M199*+5mg/mL4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)+5%（v/v）胎牛血清(FBS)+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素,然后0.22μm滤膜过滤4℃保存。临用时维持在35～37℃。*M199：通用型商品化的细胞培养液Medium199。A4卵母细胞抽吸液M199+10%（v/v）FBS+25IU/mL肝素+50μg/mL硫酸庆大霉素。A5卵母细胞成熟液M199+0.12mg/mL丙酮酸钠+10μg/mL促卵泡素(FSH)+20μg/mL促黄体生成素(LH)+1μg/mL雌二醇(E2)+10ng/mL表皮生长因子(EGF)+10%发情山羊血清(EGS)+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素，然后0.22μm滤膜过滤4℃保存。制成培养液滴临用前培养箱中平衡2h。A6精子洗涤液（SOF液）6.30mg/mLNaCl+0.53mg/mLKCl+0.16mg/mLKH2PO4+2.11mg/mLNaHCO3+0.25mg/mLCaCl2·2H2O+0.1mg/mLMgCl2·6H2O+0.642mL60%(w/v)的乳酸钠+0.036mg/mL丙酮酸钠+0.27mg/mL葡萄糖+3mg/mL牛血清白蛋白(BSA)+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素，然后0.22μm滤膜过滤4℃保存。A7获能与体外受精液SOF+10%发情山羊血清（EGS）+5μg/mL肝素+4μg/mL庆大霉素A8早期胚胎培养液SOF+0.2mM丙酮酸钠+8mg/mL牛血清白蛋白(BSA)+20μL/mLMEM*+10μL/mLBME*+100IU/mL青霉素+100ug/mL链霉素，然后用0.22μm滤膜过滤4℃保存。*商品化培养液：MEM：MinimumEssentialMedium液；BME：BasalMediumEagle’s液。A90.5mol/L的蔗糖溶液将17.15g蔗糖溶解于100mL的PBS液中，4℃保存，临用前平衡到室温。A101.6mol/L的乙二醇冷冻保存液（慢速冷冻保存液）6A1110%乙二醇PBS液按照体积比配制10%的乙二醇PBS液，然后用0.22μm滤膜过滤4℃保存，临用前平衡到室温。A12EFS30液（玻璃化冷冻保存液）首先用0.5mol/L的蔗糖溶液，配制30%（w/v）Ficoll70000(聚蔗糖)溶液作为FS液，然后在取70mL的FS液中加入30mL乙二醇,制成EFS30液，4℃保存，临用前平衡到室温。7（资料性附录）胚胎装管示意图B1慢速冷冻装管示意图①棉线，②聚乙烯粉末，③0.5mol/L的蔗糖溶液，④空气，⑤带胚胎的冷冻保存液，⑥细管塞B2玻璃化冷冻装管示意图①棉线，②聚乙烯粉末，③空气（长度0.5cm），④带胚胎的EFS30液（长度：0.6cm），⑤EFS30液（长度：0.4cm），⑥0.5mol/L的蔗糖溶液（长度：7.5cm）,⑦细管塞8