dna蛋白质的相互作用

dna蛋白质的相互作用dna蛋白质的相互作用第1页引言1.很多细胞生命活动包括到特定DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间相互作用：DNA复制和重组；mRNA转录和修饰；病毒感染与增殖等2.伴随人类基因组测序工作基础完成，功效基因组学研究显得尤为主要。而基因表示调控是功效基因组学一个主要研究领域。而要深入研究基因表达调控分子机制必须要研究DNA与蛋白质相互作用。3.在重组DNA技术发展以来，已相继分离到大量含有主要生物学意义基因。在这种情况下科学工作者开始把自己研究兴趣逐步转向DNA结合蛋白这一课题上。dna蛋白质的相互作用第2页凝胶阻滞试验DNaseI足迹试验甲基化干扰试验体内足迹试验酵母单杂交技术染色质免疫沉淀技术噬菌体展示技术核酸适体技术生物信息学方法蛋白质芯片技术及纳米技术dna蛋白质的相互作用第3页一、凝胶阻滞试验

（DNA迁移率变动试验

DNAmobilityshiftassay）1原理：在凝胶电泳中，因为电场作用，裸露DNA朝正电极移动距离与其分子量对数成反比。假如此时DNA分子与某种蛋白质结合，因为分子量增大，它在凝胶中迁移作用便会受到阻滞在特定电压和时间内朝正电极移动距离也就对应缩短了。dna蛋白质的相互作用第4页2主要步骤及内容：制备探针DNA（P32放射性同位素标识DNA）同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标识DNA条带位置不存在与DNA结合蛋白质时存在与DNA结合蛋白质时dna蛋白质的相互作用第5页凝胶阻滞试验不但能够用来判定在特殊类型细胞提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合蛋白质分子(比如特异转录因子等)，而且还能够用来研究发生此种结合作用之准确DNA序列特异性超量非标识竞争DNA(competitorDNA）dna蛋白质的相互作用第6页dna蛋白质的相互作用第7页材料及试剂：2X结合缓冲液：20mMTrispH7.5、100mMNaCl、2mMEDTA、10%甘油、

poly(dI-dC)(5mg/mlinTE)、BSA(10mg/ml)、P32-标识探针缓冲液C：20mMHEPESpH7.9、25%glycerol、420mMNaCl、1.5mMMgCl2、0.5mM二硫苏糖醇、0.5mM苯甲基磺酰氟化物、0.2mMEDTA4%天然聚丙烯酰胺凝胶(50ml)：5ml40%丙烯酰胺(30:1)、2.5ml5X四溴乙烷，41.95mlH20、0.5ml10%APS（过硫酸铵）、50ml四甲基乙二胺、0.25X四溴烷电泳缓冲夜。填充染料：0.2%溴酚蓝、0.2%二甲本蓝、50%甘油操作步骤：1.配置反应混合液：探针DNA(1ng/ml)0.1ml、dH206.3ml、2x结合缓冲液12.5ml、BSA(10mg/ml)1.0ml、poly(dI-dC)(5mg/ml)0.1ml、2.在细胞提取物中加入缓冲液C至5ml。3.加10~15mg上述溶液（£5ml)到反应混合物中，总体积应小于25ml。4.在室温下培养20min。5.加入2.5ml填充染料。6.装载样品到4%聚丙烯酰胺凝胶柱中。7.室温下跑电泳2.5h，至溴酚蓝距底部1cm处停顿。8.80℃下干燥凝胶，进行放射自显影处理。dna蛋白质的相互作用第8页二、DNaseI足迹试验

(DNaseIfootprintingassay)DNaseI足迹试验是一个测定DNA结合蛋白在DNA上准确结合位点技术。首先是单链标识，然后用DNaseI水解单链标识双链DNA，产生“DNaseI保护”，尿素变性，PAGE分离及放射性显影，形成以相差一个核苷酸为梯度一系列DNA条带，在此显影图中对应于DNA结合蛋白位置上因为DNA结合蛋白保护作用而形成了空白区域。dna蛋白质的相互作用第9页假如在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区准确序列。dna蛋白质的相互作用第10页三、甲基化干扰试验依据DMS（二甲基亚蓝）能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化G残基这一原理而设计先用DMS处理DNA；（并控制反应条件，使之到达平均每条DNA分子只有一个残基被甲基化）将这些局部甲基化DNA群体同含有DNA结合蛋白适当细胞提取物一道温育；并做凝胶阻滞试验。经电泳分离后，从凝胶中切除含有结合蛋白DNA条带和没有结合蛋白DNA条带，并用六氢吡啶处理之。dna蛋白质的相互作用第11页检测靶DNA中特异G残基优先甲基化对而后蛋白质结合作用会有什么效应，从而愈加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用模式。DMS化学干扰只能在G和A残基甲基化，不能使T和C甲基化。故本试验为足迹试验补充伎俩。dna蛋白质的相互作用第12页四、酵母单杂交技术

真核生物中，转录因子中DNA结合结构域(DNA-bindingdomainBD)与转录激活结构域(activationdomainAD)能够相互独立发生作用。酵母中转录因子GAL4DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表示蛋白能与目标基因相互作用一样可经过转录激活结构域激活RNA聚合酶开启下游汇报基因转录。dna蛋白质的相互作用第13页设计含目标基因(称为诱饵)和下游汇报基因质粒并将其转入酵母中;将文库蛋白编码基因片段与GAL4转录激活域融合表示cDNA文库质粒转化入同一酵母中;若文库蛋白与目标基因相互作用可经过汇报基因表示将文库蛋白编码基因筛选出来.注：这里作为诱饵目标基因就是开启子DNA片段，文库基因所编码蛋白就是开启子基因结合蛋白.酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作用研究。dna蛋白质的相互作用第14页不足以充分反应生理条件下，DNA与蛋白质相互作用真实情况。因为，高等生物基因组有染色质结构，用以上所提到方法分析得到某段DNA与蛋白质，在生理状态下，这段DNA很可能并不与其相对应因子相结合。另外，染色质结构本身是动态，DNA与非组蛋白在生理状态下相互作用通常是瞬时，以上方法难以捕捉到发生在染色质上基因表示调控瞬时事件以上技术都有一定不足dna蛋白质的相互作用第15页八、染色体免疫沉淀技术

Chromatinimmunoprecipitation（ChIp）1.技术介绍在生理状态下把细胞内DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打坏后，用所要研究目标蛋白特异性抗体沉淀这种交联复合体。只有与目标蛋白结合DNA片段才能够被沉淀下来dna蛋白质的相互作用第16页2、主要步骤及内容细胞甲醛固定超声波断裂染色质氯化铯等密度离心纯化交联染色质

染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体纯化交联反应逆转和DNA纯化染色质免疫沉淀DNA分析和蛋白质在DNA上结合位点判定目标蛋白和DNA靶序列特异结合深入验证

dna蛋白质的相互作用第17页1.细胞甲醛固定在1%甲醛作用下，DNA碱基上氨基或亚氨基和蛋白质上氨基包含赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸侧链氨基与另外DNA和蛋白质上氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，预防细胞内组分重新分布。加入甘氨酸来终止交联反应。

dna蛋白质的相互作用第18页2.超声波断裂染色质甲醛交联后染色质对限制酶和DnaseI高度抵抗，所以通常使用超声波使得染色质断裂。打断后染色质片段平均长度应该在500-1000bp左右。（能够用琼脂糖凝胶电泳来判定）dna蛋白质的相互作用第19页3.氯化铯等密度离心纯化交联染色质氯化铯等密度离心能够除去未交联蛋白质、DNA和RNA样品中加入0.5%十二烷基肌氨酸钠，通常在4000rpm离心72h。离心后，用连接到蠕动泵0.25mm毛细管从梯度底个别步搜集染色质组分，在4℃透析过夜。dna蛋白质的相互作用第20页4.染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体纯化用目标蛋白特异性抗体进行染色质免疫沉淀。抗体量要进行优化预防非特异结合。用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀复合体。经过洗涤除去非特异结合染色质后，用1%SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合体。dna蛋白质的相互作用第21页5.交联反应逆转和DNA纯化在免疫沉淀复合体中加入不含DnaseRnase，proteinaseK。65℃保温6h使交联逆转。经酚氯仿抽提-乙醇沉淀纯化DNA。纯化DNA极少，可用色谱定量。dna蛋白质的相互作用第22页6.染色质免疫沉淀DNA分析和蛋白质在DNA上结合位点判定染色质免疫沉淀DNA分析方法有许各种。假如目标蛋白靶序列是已知或者怀疑某个序列是目标蛋白靶序列，能够采取狭缝杂交和PCR分析;假如目标蛋白靶序列未知或者高通量研究目标蛋白在基因组上分布情况,找出反式作用因子结合位点,能够采取Southern杂交、ChIP克隆和DNA芯片方法。dna蛋白质的相互作用第23页7.目标蛋白和DNA靶序列特异结合深入验证

染色质免疫沉淀分析得到结果有很大一个别是假阳性，需要采取其它方法验证结果真实性。用PCR方法进行独立ChIP分析、电泳迁移率变动分析、酵母单杂交系统及荧光素酶汇报系统最终确定目标蛋白与靶DNA序列特异性结合。dna蛋白质的相互作用第24页多年来发展起来基因芯片（chip）染色质免疫沉淀ChIP技术相结合(chip-ChIP)方法要一个PCR步骤来扩增染色质免疫沉淀富集DNA。特异性染色质免疫沉淀DNA和对照DNAPCR产物分别用Cy5和Cy3荧光光标识，用于与含有整个基因组DNA芯片进行杂交。经过比较两种