基因工程原理与技术专家讲座

第八章基因文库构建与目标基因取得基因文库(genelibrary)是指某种生物、组织、或细胞全部DNA片段克隆群体。包含基因组文库(genomiclibray)和cDNA文库(cDNAlibrary)。第一节基因组文库构建一、理想基因组文库应具备条件1、代表性高，要包含基因组全部DNA序列；2、克隆数不宜过大，以减轻文库筛选工作量；

N=ln(1-P)/ln(1-f)N:文库克隆数;P:筛选目标序列概率;

f:插入片段与基因组大小比值3、载体克隆容量要大于基因长度，防止基因被分割克隆；4、克隆之间必须存在足够长度重合区域以利确定克隆之间关系。基因工程原理与技术专家讲座第1页二、用于构建基因组文库载体

1、λ噬菌体载体

基因工程原理与技术专家讲座第2页2、黏粒载体

基因工程原理与技术专家讲座第3页3、酵母人工染色体载体

转化酵母基因工程原理与技术专家讲座第4页三、基因组文库构建程序1、基因组DNA克隆片段制备①高分子量基因组DNA提取②DNA克隆片段制备

机械剪切法(移液器抽吸法、超声波裂解法)：随机性高，但产生平头末端DNA片段，连接效率不高。

限制酶消化法(Sau3AI、MboI、HaeⅢ)：有非随机倾向，但产生黏性末端DNA片段，连接效率高。2、载体DNA片段制备①酶切；普通用BamHI，产生与基因组DNA克隆片段相匹配黏性末端。②碱性磷酸酶处理；

③载体DNA片段纯化。有机溶剂抽提乙醇沉淀法、蔗糖密度梯度离心法。

基因工程原理与技术专家讲座第5页3、基因组DNA片段与载体连接(重组DNA分子构建)连接效率主要受插入片段与载体摩尔数比以及DNA片段总浓度影响。所以，应经过连接预试验确定连接反应中载体臂和插入片段用量。

1.0μgλ噬菌体载体臂需要插入片段用量连接效率低处理办法：①调整载体与插入片段用量；

②使用新鲜购置连接酶；③重新纯化基因组DNA片段；④重新提取和制备基因组DNA片段。

基因工程原理与技术专家讲座第6页4、重组DNA分子导入受体细胞对于λ噬菌体载体、黏粒载体，重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒，以噬菌体感染方式将重组DNA分子导入到大肠杆菌中。效率高，达1.8×108pfu/μgDNA。对于YAC载体，采取电激法导入重组DNA分子。5、转化体筛选培养及基因组文库取得6、基因组文库扩增、分装及保留

基因组文库扩增方法：液体培养增殖法、影印滤膜培养法。

基因组文库扩增问题：因为克隆不均衡生长，从而造成对应克隆丢失，造成基因组文库代表性变差。小包装保留，4℃保留六个月、-80℃保留几年而滴度保持稳定。

基因工程原理与技术专家讲座第7页第二节cDNA文库构建cDNA文库是指某生物、组织或细胞全部cDNA克隆群体。包含组织特异性cDNA文库、区域特异性cDNA文库。一、用于构建cDNA文库载体及载体片段制备质粒载体、λ噬菌体载体，能满足0.5~10kbcDNA克隆。二、mRNA提取及其完整性确实定1、mRNA起源(取材)目标mRNA为高丰度材料2、mRNA提取

olig(dT)n-纤维素柱层析法

olig(dT)n-磁珠分离法基因工程原理与技术专家讲座第8页3、mRNA完整性确实定无细胞翻译系统检测法(麦胚抽提物、免网状细胞裂解物)蛙卵检测法凝胶电泳检测法(依据28srRNA与18srRNA条带亮度判定)4、mRNA富集

尤其是低丰度mRNA。琼脂糖凝胶电泳法：回收率较低变性蔗糖密度梯度离心法：回收率高现在，普通是进行cDNA富集。操作烦琐、时间长基因工程原理与技术专家讲座第9页三、cDNA克隆片段制备1、cDNA第一链合成

AAAAAAAAAGppp引物(OligdT17)退火AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT逆转录酶、dNTPAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT鸟类骨髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶：RNaseH活性强莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶：RNaseH活性较弱，有利于全长cDNA合成。Supscript逆转录酶：缺失RNaseH活性，反应温度较高(45℃)基因工程原理与技术专家讲座第10页2、cDNA第二链合成

①本身引导合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT煮沸NaOHTTTTTTTTTTTTTTTTTT形成发夹环DNA聚合酶TTTTTTTTTAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAS1核酸酶造成5’端缺失基因工程原理与技术专家讲座第11页②置换合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTRNaseHAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTPolIAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTDNA连接酶优点：a、效率高；b、不需纯化cDNA第一链；c、仅缺失5’端几个核苷酸。基因工程原理与技术专家讲座第12页③PCR合成法

优点：a、灵敏度高，对起始材料少、低丰度mRNA尤其含有优势；b、不需纯化mRNA，防止了纯化过程中信息丢失；c、不会丢失5’端信息基因工程原理与技术专家讲座第13页3、双链cDNA末端处理及甲基化修饰

①加同聚物尾

基因工程原理与技术专家讲座第14页②接上人工接头首先补平cDNA末端及甲基化修饰，然后再接上人工接头。连接子(linker)基因工程原理与技术专家讲座第15页衔接头(adaptor)基因工程原理与技术专家讲座第16页四、cDNA克隆片段与载体片段连接及检测1、平头末端连接法，无法回收插入片段2、同聚物接尾法，接dA/dT，经过局部变性和S1处理往返收3、人工接头法五、重组cDNA分子导入受体细胞如构建质粒文库，要有高质量大肠杆菌感受态细胞(109pfu/μgDNA)六、转化体筛选培养及cDNA文库生成七、cDNA文库扩增、分装及保留值得注意是：在构建cDNA文库时，假如用人工接头法，在酶切之前要用甲基化酶保护cDNA中对应酶切位点。

普通情况下无需构建原核细菌cDNA文库。

基因工程原理与技术专家讲座第17页第三节目标基因取得

取得目标基因主要路径：①筛选基因组文库；②筛选cDNA文库；③PCR扩增目标基因；④人工合成法；⑤差异克隆法；⑥图位克隆法；⑦转座子标签法；⑧T-DNA标签法序列已知基因未知序列基因⑨基因组计划基因工程原理与技术专家讲座第18页一、从文库中分离已知序列基因1、核酸杂交法(菌落/噬菌斑原位杂交)

利用部分同源探针能够分离不一样种属相同基因或同一基因家族不一样组员。

假如只知基因编码蛋白质氨基酸序列，能够设计简并探针给予筛选。基因工程原理与技术专家讲座第19页2、PCR筛选法

特点：快速、简便。

程序：文库→多孔培养板

→一列或一行培养物于一PCR管中扩增→凝胶电泳检测

→阳性列或行分装培养

→第二轮PCR

→

→

→

→阳性克隆3、免疫学筛选

特点：筛选表示文库

程序：与核酸杂交筛选相同。见右图

基因工程原理与技术专家讲座第20页二、从文库中分离未知序列基因1、染色体步移法(图位克隆法