生化蛋白质化学专家讲座

第二章蛋白质(Protein)化学蛋白质存在于全部生物细胞中，是组成生物体最基本结构物质和功效物质。蛋白质是生命活动物质基础，它参加了几乎全部生命活动过程。生化蛋白质化学专家讲座第1页学习目标与要求:1.蛋白质化学基本组成单位。2.氨基酸结构、性质及分离测定方法。3.肽及其结构。4.蛋白质结构，性质，功效及分离纯化与测定原理方法。

重点1.氨基酸结构及性质。2.蛋白质结构、性质、功效。3.氨基酸及蛋白质分离测定方法。难点1.氨基酸两性性质。2.蛋白质一级结构测定3.蛋白质二级结构关键点4.蛋白质结构与功效关系。生化蛋白质化学专家讲座第2页1.蛋白质是生物体内结构高分子

蛋白质占干重人体中（中年人）人体45%水55%细菌50%~80%蛋白质19%真菌14%~52%脂肪19%酵母菌14%~50%糖类＜1%白地菌50%无机盐7%

2.蛋白质是一个生物体内功效高分子

（1）酶催化作用（2）调整作用(多肽类激素)（3）运输功效（4）运动功效（5）免疫保护作用(干扰素)（6）接收、传递信息受体（7）毒蛋白生化蛋白质化学专家讲座第3页

第一节蛋白质分子组成成份一.元素组成这些元素在蛋白质中组成百分比约为：碳50—55％氮15—17%铁,锌,锰,钼,碘,铜等氢6—8％硫0—4％氧20—23％磷0—1%蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少许硫。一些蛋白质还含有其它一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。其中氮含量较恒定，平均16%。一克氮=6.25克蛋白质。这是凯氏定氮法依据。生化蛋白质化学专家讲座第4页二.蛋白质水解酸水解：蛋白质氨基酸碱水解：蛋白质氨基酸酶水解：蛋白质氨基酸证实：氨基酸是蛋白质基本组成单位生化蛋白质化学专家讲座第5页RCHNH3+COO-三.基本组成单位氨基酸（一）氨基酸结构通式1.特点氨基酸结构决定了有以下特点：①含有酸性羧基和碱性氨基②

α-碳为手性碳原子③因为R侧链不一样或分子型离子型生化蛋白质化学专家讲座第6页2.非蛋白氨基酸NH2CH2CHCOOHCH2CH2NH2CONHCH2CHCOOHCH2OHNH2

高丝氨酸：β-丙氨酸：γ-氨基丁酸：鸟氨酸：瓜氨酸：生化蛋白质化学专家讲座第7页HONCOOHH高半光氨酸：HS-CH2-CH2-CH-COOHNH24-羟脯氨酸：胱氨酸：H2N-CH-CH2-S-S-CH2-CH-NH2COOHCOOH4-羟赖氨酸：H2N-CH2-CH-CH2-CH2-CH-COOHOHNH2

生化蛋白质化学专家讲座第8页

中性AA（15种）（1）按R基团酸碱性分类酸性AA（Glu，Asp）碱性AA(His,Arg,Lys)（2）按R基团疏水性R基团AA极性分类不带电荷极性R基团AA亲水性R基团AA正电荷带电荷R基团AA负电荷

脂肪族AA（3）按R基团芳香族AA化学结构分类杂环族AA

杂环亚AA（二）.氨基酸分类生化蛋白质化学专家讲座第9页

生化蛋白质化学专家讲座第10页第二节氨基酸性质一、氨基酸光学活性和光吸收性质CHOCHOHCH2OHL—（-）—甘油醛L—氨基酸CHOCHOHCH2OHD—（+）—甘油醛D—氨基酸生化蛋白质化学专家讲座第11页酪氨酸max＝278nm，278=1.4x103;苯丙氨酸max＝259nm，259=2.0x102;色氨酸max＝279nm，279=5.6x103;氨基酸光吸收生化蛋白质化学专家讲座第12页二.氨基酸两性离解性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。H3N-CH-COOHR+H3N-CH-COO-R+H2N-CH-COO-R-pK1+H+H+-pK2+H+H+“+”正离子PH<PI“0”两性离子PH=PI“-”负离子PH>PI1.两性离子同一分子中现有带正电荷离子又有带负电荷离子，这种离子称为两性离子。生化蛋白质化学专家讲座第13页

2.氨基酸等电点在一定pH值时，氨基酸分子中氨基离解度等于羧基离解度时，所含-NH3+和-COO-数目恰好相等，净电荷为0。在电场中既不向正极移动，也不向负极移动，这一pH值即为氨基酸等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。生化蛋白质化学专家讲座第14页3.氨基酸等电点计算H3N-CH-COOHR+H3N-CH-COO-R+H2N-CH-COO-R-pK1+H+H+-pK2+H+H+K1=H3N-CH-COOHR+H3N-CH-COO-R+*H+H2N-CH-COO-RK2=H3N-CH-COO-R+*H+K1*H3N-CH-COOHR+H3N-CH-COO-R+*H+H2N-CH-COO-RK2=H3N-CH-COO-R+*H+*生化蛋白质化学专家讲座第15页K1*H3N-CH-COOHR+H2N-CH-COO-RK2=H+*2等电点时：H3N-CH-COOHR+H2N-CH-COO-R=K1*K2=H+2等式两边取负对数-logK1+(-logK2)=2(-log[H+])pK1+pK2=2pH侧链不含离解基团中性氨基酸，其等电点是它pK’1和pK’2算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2

生化蛋白质化学专家讲座第16页一样，对于侧链含有可解离基团氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边pK’值算术平均值。酸性氨基酸：pI=(Pkα-COOH+pKR-COOH)/2碱性氨基酸：pI=(pKα-NH2+pKR-NH2)/2

pH>PI溶液对PI而言偏碱带+PI与PH关系pH=PI溶液对PI而言中性不带电pH<PI溶液对PI而言偏酸带-

等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和二分之一或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和二分之一生化蛋白质化学专家讲座第17页Lys解离以下：KCOOHKε-Kα-ε-H+H+H+（++）（+）（±）（-）生化蛋白质化学专家讲座第18页Asp解离以下:Kα-COOHKβ-COOHKα-H+H+H+β-COOH（+）（-）（--）（±）生化蛋白质化学专家讲座第19页4.依据滴定曲线求pK6.022.349.69丙氨酸滴定曲线生化蛋白质化学专家讲座第20页三.氨基酸化学反应1.与甲醛反应（一）.氨基参加反应生化蛋白质化学专家讲座第21页2.与亚硝酸反应RCHNH3+COO-RCHON2CO2HNO2+++此反应是Vanslyke定氮原理生化蛋白质化学专家讲座第22页3.与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应生化蛋白质化学专家讲座第23页4.与异硫氰酸苯酯（PITC）反应NHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2+生化蛋白质化学专家讲座第24页5.与丹磺酰氯反应:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）能够与N-端氨基酸游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法优点是丹磺酰-氨基酸有很强荧光性质，检测灵敏度能够到达1

10-9mol。生化蛋白质化学专家讲座第25页

（二）.羧基参加反应——肼解反应此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水物质而与C-端氨基酸分离。生化蛋白质化学专家讲座第26页（三）.氨基和羧基共同参加反应——茚三酮反应00000H00HH2O00H0HH2N-CH-COOHRNH3+RCHO+CO200H00H00H0H+NH3+00H00H0=N0O-O蓝紫色化合物入max=570nm生化蛋白质化学专家讲座第27页脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质入max=440nm00H00HCCCO-ON+CO2HNCOOH生化蛋白质化学专家讲座第28页反应名称反应试剂反应基团颜色用途黄色反应浓硫酸+浓硝酸苯基、酚基黄色PheTyr米伦反应硝酸汞（亚汞）酚基红色Tyr乙醛酸反应乙醛酸吲哚基紫红Trp坂口反应萘酚+NaClO胍基红色Arg福林酚反应磷钼酸+磷钨酸酚基、吲哚基蓝色TrpTyrPauly反应重氮盐咪唑基酚基棕红色桔黄色HisTyr巯基反应亚硝酸亚铁氰酸钠巯基红色Cys（四）R-侧链反应-呈色反应生化蛋白质化学专家讲座第29页第三节.氨基酸分离与测定一.层析法二.电泳法三.氨基酸测定生化蛋白质化学专家讲座第30页第四节肽一.肽结构氨基酸残基肽单位生化蛋白质化学专家讲座第31页生化蛋白质化学专家讲座第32页二.生物活性肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

Met-脑啡肽

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽H2N-CHCH2CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2COOHCOOHCH2

SH2GSHGS-SG1.谷胱甘肽2.脑啡肽

生化蛋白质化学专家讲座第33页

Leu-(D)phe-pro-val-OrnOrn-val-pro-(D)phe-Leu4.短杆菌肽S（Orn鸟氨酸）3.催产素生化蛋白质化学专家讲座第34页第五节蛋白质分类一.依据蛋白质分子形状分类1.球状蛋白2.纤维状蛋白二.依据蛋白质组成成份分类1.单纯蛋白2.结合蛋白清蛋白核蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白色蛋白精蛋白和组蛋白糖蛋白硬蛋白脂蛋白磷蛋白生化蛋白质化学专家讲座第35页第六节蛋白质一级结构一.蛋白质氨基酸组成1.蛋白质氨基酸组成可用残基重量百分数表示147165如：100克胰岛素分析得到phe8.6克，其重量百分数为：残基分子量氨基酸含量*=8.6*=7.7克氨基酸分子量2.依据百分组成计算氨基酸分子个数如：胰岛素分子量为6000，丙氨酸占4.6%，氨基酸个数为：==34.6%*600089氨基酸百分含量*蛋白质分子量氨基酸分子量生化蛋白质化学专家讲座第36页a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键二.蛋白质分子结构中化学键维系蛋白质分子一级结构：肽键维系蛋白质分子二级结构：氢键维系蛋白质分子三级结构：疏水相互作用力维系蛋白质分子四级结构：范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用力生化蛋白质化学专家讲座第37页离子键氢键范德华力疏水相互作用力氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力即使键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构尤其主要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很主要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定生化蛋白质化学专家讲座第38页三.蛋白质一级结构测定（一）氨基酸组成成份分析（二）末端分析1.N-末端2.C-末端（三）肽链伸展与分离（四）肽链部分水解与肽段分离（五）肽段氨基酸次序测定（六）由各段次序推断氨基酸次序生化蛋白质化学专家讲座第39页生化蛋白质化学专家讲座第40页化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸羧基所形成肽键。生化蛋白质化学专家讲座第41页酶法-HN-CH-CO-NH-CH-CO——R1R2胰酶：R1=Lys.Arg胰凝乳酶：R1=phe.Tyr.Trp胃酶：R1R2=phe.Tyr.Trp.leu嗜热菌蛋白酶：R2=phe.Tyr.Trp.leu.Ile.valGlu酶：R1=Glu.AspArg酶：R1=Arg生化蛋白质化学专家讲座第42页第七节蛋白质高级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构高级结构α-螺旋β-折叠β-转角自由回折高级结构概念：生化蛋白质化学专家讲座第43页1.α-螺旋一.二级结构关键点：螺旋角度与高度维持螺旋作用力影响螺旋稳定原因螺旋种类生化蛋白质化学专家讲座第44页2.β-折叠关键点：肽链走向（种类）残基轴心距离维持作用力影响螺旋稳定原因生化蛋白质化学专家讲座第45页3.β-转角4.自由回折氢键1800回转生化蛋白质化学专家讲座第46页ααβββαβ二.超二级结构βββ生化蛋白质化学专家讲座第47页三.三级结构关键点：形状折叠作用力生化蛋白质化学专家讲座第48页四.四级结构生化蛋白质化学专家讲座第49页一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构生化蛋白质化学专家讲座第50页第八节蛋白质分子结构与功效一.一级结构与功效关系1.胰岛素结构与功效生化蛋白质化学专家讲座第51页2.血红蛋白结构与功效生化蛋白质化学专家讲座第52页3.细胞色素C与生物进化生化蛋白质化学专家讲座第53页生化蛋白质化学专家讲座第54页二.蛋白质构象与功效关系生化蛋白质化学专家讲座第55页三.个别蛋白质结构与功效1.纤维状蛋白——角蛋白生化蛋白质化学专家讲座第56页2.丝心蛋白生化蛋白质化学专家讲座第57页第九节蛋白质性质一.蛋白质分子大小1.依据化学成份测定最小相对分子质量据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量＝（成份相对分子或原子质量）已知成份百分含量2.沉降系数一个S单位，为1×10-13秒蛋白质沉降系数：1～200S，相对分子质量越大，S值越大由沉降系数S可依据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子相对分子质量：M=RST/D〔1－iρ〕R：气体常数T：绝对温度D：扩散系数ρ：溶剂密度S=dx/dtω2x生化蛋白质化学专家讲座第58页

蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质溶解度最小，在电场中不移动。在不一样pH环境下，蛋白质电学性质不一样。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。因为蛋白质分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液含有胶体溶液经典性质，如丁达尔现象、布郎运动等。因为胶体溶液中蛋白质不能经过半透膜，所以能够应用透析法将非蛋白小分子杂质除去。二.蛋白质两性离解