蛋白质的复性

蛋白质的复性蛋白质的复性第1页蛋白质复性为何要进行蛋白质复性？外源基因导入E.coli等宿主细胞并表示蛋白质产物（r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素等）时，相当多产物形成了包涵体，而没有蛋白质活性。所以要进行蛋白质复性。1.什么是包涵体？2.为何选择原核表示系统（尤其是E.coli）？蛋白质的复性第2页蛋白质复性蛋白质的复性第3页包含体（inclusionbody,IB）是外源基因在原核细胞中表示时，尤其在大肠杆菌细胞中高效表示时，形成由膜包裹高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中其它成份有显著区分。蛋白质的复性第4页蛋白质复性

包含体形成原因包涵体形成比较复杂，有些机理还不清楚；

(1)表示量过高：包含体形成与细胞内蛋白质生成速率相关，新生成多肽浓度较高，无充分时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形蛋白质聚集体；

(2)包含体形成还被认为与宿主菌培养条件，如培养基成份、温度、pH值、离子强度、氧化还原电势及蛋白质转运系统功效等原因相关。

(3)大肠杆菌生长过程在受到一些原因影响时，其本身蛋白质表示也可出现异常，造成蛋白质聚集从而形成包含体。蛋白质的复性第5页蛋白质复性包含体形成原因（4）重组蛋白氨基酸组成（5）重组蛋白时大肠杆菌异源蛋白，缺乏一些蛋白折叠过程中所需要酶和辅助因子。（6）在细菌表示蛋白过程中，蛋白质分子间离子键、疏水键或共价键等化学作用造成了包涵体形成。蛋白质的复性第6页蛋白质复性

包含体形成优势形成包含体对克隆基因表示产物蛋白质含有保护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解不稳定多肽，许多可溶性重组蛋白质对这些酶敏感，使得利用细菌作为表示宿主时受到限制，然而隔离在包含体内蛋白质可免受蛋白酶降解作用；另外对宿主菌有毒性重组蛋白以无活性聚集体形式存在也能够降低对宿主菌毒害作用。优势:包含体可防止被水解酶水解蛋白质的复性第7页蛋白质复性包含体理化特征⑴大个别包含体不能渗透出细胞，需要人工进行细胞破碎来进行释放产物。⑵大个别包含体在细胞内凝聚成没有活性颗粒固体（r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素）特点：包含体组成基础上由蛋白质组成，其中大部分（占50%以上）是基因工程产品，产物一级结构是正确，但立体结构是错误，没有生物学活性。蛋白质的复性第8页蛋白质复性

基因表示系统普通分为真核表示系统和原核表示系统。因为真核表示系统如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等产生重组蛋白价格高、产量低，而且操作复杂、产品周期长，而原核表示系统培养成本低、生长快、表示量高、基因操作方便，所以，当前它们仍是基因工程主要表示系统，尤其是大肠杆菌。大肠杆菌重组菌

有各种可选择质粒；重组遗传背景清楚，基因表示易于控制；蛋白表示量高（可达总蛋白50％）；但原核表示系统也有一个问题，很多外源蛋白在E.coli细胞内表示时往往以不溶，无活性包含体形式存在。若能处理包含体问题，原核表示系统就可得到更广泛应用。蛋白质的复性第9页蛋白质复性现就包含体形成预防、分离、溶解、复性作一综述。1.预防包含体形成方法2.包含体分离、溶解3.包含体复性蛋白质的复性第10页蛋白质的复性第11页蛋白质复性预防包含体形成方法1.

形成分子伴侣

分子伴侣是什么

参加帮助新生肽链体内折叠一类蛋白质，包含：核质素，热休克蛋白60家族（Hsp60），热休克蛋白70家族（Hsp70），热休克蛋白90家族（Hsp90）和其它种类分子伴侣

分子伴侣对新生肽链折叠促进作用

①使前体蛋白处于一个涣散折叠构象而含有跨膜、折叠或组装能力；②在肽链折叠过程中经过与折叠中间体上暴露疏水区域结合而预防肽链分子间发生反应，妨碍肽链进入错误折叠路径

应用分子伴侣策略

可采取表示外源基因同时，共表示分子伴侣策略。比如，GroES和GroEL可显著提升D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）折叠、组装效率，从而提升可溶性重组蛋白产量；也能提升可溶性乙酰辅酶A脱氢酶产量和组装效率；对可溶性β-葡萄糖苷酶表示也有提升蛋白质的复性第12页蛋白质复性预防包含体形成方法

2.经过改变、优化培养条件增加表示产物可溶性.

为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，大家在培养条件优化方面进行了多方面探索。（I）经过降低培养温度能够使人干扰素

2和干扰素γ可溶性组分提升。这些蛋白在37℃下表示时以包含体形式存在，当将培养温度降到23~30℃时,其可溶性组分可达30%~90%。蛋白质的复性第13页蛋白质复性预防包含体形成方法

2.经过改变、优化培养条件增加表示产物可溶性.为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，大家在培养条件优化方面进行了多方面探索。（II）利用丰富培养基,可使T4噬菌体脱氧胞苷酸脱氨酶基因进行可溶性表示，表示量占细胞可溶性蛋白总量20%，而在最低培养基中，此酶以包含体形式表示。（III）改变培养基渗透压、降低pH值等方法也能够到达降低包含体目标。经过优化发酵条件改进基因表示产物方法即使可行，然而也需要对详细问题进行详细分析、试验。蛋白质的复性第14页蛋白质复性预防包含体形成方法

3．经过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基酸取代，来增加重组蛋白可溶性。此方法前提是氨基酸取代不能使蛋白活性受到影响。经过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷电性质，降低蛋白分子之间聚集，从而预防包含体形成。如上所述，各种原因影响外源基因可溶性表示。对于怎样取得天然构象和活性可溶蛋白质技术方法，当前均无统一模式，只能经过详细试验来确定。蛋白质的复性第15页蛋白质的复性第16页蛋白质的复性第17页

蛋白质复性蛋白质复性主要步骤：破碎细胞分离出包含体溶解包含体目标构建构型复原对复性蛋白进行纯化取得高纯度蛋白。包含体颗粒内并不一定多是表示产物，也可能含有其他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等.蛋白质的复性第18页蛋白质复性主要蛋白质复性基础步骤和联合试验以下：（1）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）离心法提取出包含体加变性剂溶解除变性剂复性。（2）机械破碎膜分离可溶性蛋白变性溶解包含体除变性剂复性。（3）化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片出除变性剂复性。蛋白质的复性第19页蛋白质复性

路线1特点：

方法（1）：利用了包含体与细胞破碎片密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性性蛋白质分开，取得包含体，再对包含体溶解后，复性，摆脱大量杂蛋白，核酸，热原，内毒素等杂质。优点：分离步骤简单；缺点：经几次离心后，才能除去大个别细胞碎片，加工时间长。蛋白质的复性第20页蛋白质复性蛋白质的复性第21页蛋白质复性

路线2特点：

方法（2）：应用膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点：可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污染，耗能少。缺点：膜堵塞和浓度极化常造成可溶性蛋白质滞留，这项技术问题较多。

蛋白质的复性第22页蛋白质复性

路线3特点：方法（3）：所用试剂即能够破菌，又能够溶解包含体。将两道工序合为一道，节约了设备和时间，比前二者更适合试验室操作。

缺点：混有杂质，不易分离。蛋白质的复性第23页蛋白质复性包含体复性方法

包含体蛋白质复性是指使包含体内变性蛋白质恢复其天然三维空间结构从而含有生物学活性过程.普通分为以下几个方法:

1.

经过变性-复性方法取得正确构象和生物活性重组蛋白.这是一个较通用方法.蛋白质的复性第24页蛋白质复性包含体复性方法将经过细胞破碎,离心分离,多步清洗得到”纯净”包含体,在强变性剂(5~8mol/L尿素或5~8mol/L盐酸胍)中变性增溶,再将变性蛋白质稀释到适当复性缓冲液中,或经过对复性缓冲液透洗\浓缩,最终得到重折叠重组蛋白.在溶液中变性-复性方法关键是优化折叠液和操作步骤,尤其是对分子内含多个二硫键蛋白质更是如此.在此过程中,影响复性蛋白产率原因有:蛋白质的复性第25页蛋白质复性包含体复性方法影响复性蛋白产率原因：

(1)复性蛋白浓度,为预防蛋白质分子间发生聚集,复性蛋白浓度要尽可能稀,普通控制在25-75ug/mL为好.(2)复性缓冲液要保持适当氧化还原条件.普通GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比为1为好.(3)复性缓冲液pH要经过试验来确定最适值.(4)复性溶液中要加入适当labilizing试剂,如L精氨酸,可提升复性产率.

蛋白质的复性第26页蛋白质复性包含体复性方法影响复性蛋白产率原因：

(5)复性温度也是一个影响原因,普通在低温下(4-10℃)进行.(6)为预防聚集发生,复性时,可采取分步加入变性蛋白操作方法.

在溶液中变性-复性方法受各种原因影响,且对不一样蛋白质所需最适条件可能又不相同,所以对于一个特定重组蛋白复性要经过试验找出最适条件.蛋白质的复性第27页蛋白质复性包含体复性方法影响复性蛋白产率原因：（7）复性辅助因子变性剂、糖、氨基酸、表面活性剂（8）稀释倍数蛋白质的复性第28页蛋白质复性影响原因

浓度

增加蛋白质浓度有利于聚集进行温度

蛋白质复性普通在室温下进行，温度过高（＞40℃）蛋白质聚集将十分严重

pH值

通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意防止与蛋白pI值相近折叠促进剂

L-Arg,PEG,去污剂,尿素和盐酸胍蛋白质的复性第29页蛋白质复性

复性操作方法：

2.稀释和透析复性稀释法：将溶液稀释，造成变性剂浓度降低，蛋白质开始复性。透析法：利用透析或电渗析超滤除去变性剂，使蛋白质开始复性。缺点：透析时间长，易形成蛋白质沉淀。蛋白质的复性第30页蛋白质的复性第31页蛋白质的复性第32页蛋白质复性

蛋白质复性存在问题：蛋白质复性是十分复杂过程，其中目标产品复性率非常低，普通不超出20%，其原因在于当变性剂稳定后，蛋白质分子可能重新聚合成二聚体，三聚体或多聚体，甚至形成沉淀物。现有提升蛋白质复性收率有：反胶束法复性，单克隆抗体帮助复性及保护复性等。蛋白质的复性第33页蛋白质复性红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度对复性影响蛋白质的复性第34页蛋白质复性

红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度对复性影响图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。降低盐酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使系统进入多聚体区和絮凝区。要降低复性损失，就必须使操作处于复性界限之上。蛋白质的复性第35页蛋白质的复性第36页蛋白质的复性第37页蛋白质复性

复性操作方法：

3.色谱复性（1）凝胶过滤色谱为代表非吸附型色谱。（2）吸附型色谱复性，其中常见金属螯合色谱复性，亲合色谱复性，离子交换色谱复性。蛋白质的复性第38页色谱法复性色谱复性方法原理复性蛋白凝胶色谱（SEC）蛋白质Stokes半径差异和凝胶排阻作用溶菌酶，牛碳酸酐酶，E.coli宿主整合因子，rhETS-1，RNaseA，t-PA，Heterodimericplatelet-derivedgrowthfactor疏水色谱（HIC）蛋白质与介质疏水性相互结合rhIFN-γ，rhIFN-β，重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF离子交换色谱（IEC）蛋白质与介质间存在电荷作用力Papilomavirus(HPV)，E7MS2fusionprotein，重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白亲和色谱（AFC）蛋白与配体特异性亲和吸附重组人朊病毒rhPrion，牛碳酸酐酶，IgG蛋白质的复性第39页蛋白质复性

复性操作方法：

4.凝胶过滤色谱复性经过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离,从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性.举例:核糖核酸酶蛋白质的复性第40页蛋白质复性

包含体复性

4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性.

普通做法是将1-10mg蛋白质溶入1-2mL变性缓冲液中,使蛋白充分变性(普通在室温下数小时或过夜),然后在superdex75HR10/30或sephacryIS系列柱上进行蛋白质分子重折叠,从凝胶过滤柱上洗脱下来样品经超滤浓缩回收.利用此法成功地使分子内有9个半胱氨酸,分子量为50000Da重组人ETS-1蛋白有效地复性,其构象和天然构象相同.蛋白质的复性第41页蛋白质复性

包含体复性

4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性.

此方法另一特点是,