深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座

细胞培养中细节问题深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第1页基础篇-无菌操作基本技术1.试验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始试验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以防止失误混同或细胞间污染。试验完成后，将试验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽大，必要物品，比如试管架、吸管吸收器或吸管盒等能够暂时放置，其它试验用具用完即应移出，以利于气流之流通。试验用具以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。试验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3.小心取用无菌之试验物品，防止造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作试验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽可能勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第2页4.工作人员应注意本身之安全，须穿戴试验衣及手套后才进行试验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应尤其小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(最少ClassII)。操作过程中，应防止引发aerosol之产生，小心毒性药品，比如DMSO及TPA等，并防止尖锐针头之伤害等。

5.定时检测以下项目：

5.1.CO2钢瓶之CO2压力

5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘水用无菌水，每七天更换)。

5.3.无菌操作台内之airflow压力，定时更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。

6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定时更换水槽水。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第3页基础篇-试验用具1.种类︰

1.1.细胞培养试验用具均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。

1.2.TC级培养盘表面都有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates,dishes,rollerbottle等，依试验需要使用。

1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

1.4.塑料离心管:15ml,50ml，都有2种不一样材质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依试验需要而选择适合材质之离心管。

1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。

1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第4页2.清洗︰

2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。

2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗洁净，勿加清洁剂清洗。

3.灭菌︰

3.1.试验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟，置于oven中烘干。

3.2.试验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃,4小时。

3.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121℃,15lb,20分钟处理。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第5页基础篇-培养基1.液体培养基贮存于4℃冰箱，防止光照，试验进行前放在37℃水槽中温热。

2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，能够再添加适量glutamine。

3.粉末培养基配制(以1升为例)：

3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，所以粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。所以粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基pH易发生改变。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第6页3.2.材料：

纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常主要)，粉末培养基，NaHCO3，电磁搅拌器无菌血清瓶，0.1或0.2mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体

3.3.步骤：

3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，不然不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦经过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)

3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第7页附-配制培养基之生长测试材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步骤：

1.以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中，每个well接种1×102活细胞，同时作对照组试验。

2.接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到能够肉眼观察，而群落间不相互接触时即可。

3.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室温下静置10min。

4.去除固定液，水洗二次。

5.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

6.去除染液，水洗二次。

7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第8页基础篇-抗生素1.细胞库之细胞培养基不加抗生素

1.1.培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。

1.2.培养自其它试验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待tokenfreeze经过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。

3.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第9页4.去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后药品毒性会增强。

5.抗生素使用种类与浓度：

工作浓度.储存温度.杀灭细菌

penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma

amphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第10页基础篇-血清1.血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超出一个月。假如一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，因为血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，不然易发生污染或容器冻裂之情形。

2.普通厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发觉血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3.瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，普通以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇摆均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成份均一，降低沈淀发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，轻易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第11页4.heat-inactivation是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇摆均匀。此热处理之目标是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，普通不提议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参加之反应有：cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。

5.勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会所以受到破坏，而影响血清之品质。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第12页6.血清之沈淀物

6.1.凝絮物：发生之原因有许各种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲降低这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液能够加入培养基中一起过滤。不提议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。

6.2.显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物形成会显著增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。普通而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应马上停用，更换另一批号血清。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第13页附-血清之生长测试材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL1-022)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

步骤：

1.以a-MEMwith10%FBS(已测试过)培养MDCK细胞于T75flask至80%confluency。

2.以trypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ml。

3.将1ml细胞悬浮液接种入6-wellplate中，并另加入1ml含不一样浓度血清(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)之a-MEM，使血清最终浓度为10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。用已测试过之血清同时进行对照组试验。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第14页4.37oC，5%CO2培养箱培养5-7天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到能够肉眼观察，而群落间不相互接触即可。

5.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室温下静置10min。

6.去除固定液，水洗二次。

7.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

8.去除染液，水洗二次。

9.以肉眼计数群落数

10.计算SPE(SerumPlatingEfficiency)：

SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%

11.计算RPE(RelativePlatingEfficiency)：

SPE=[totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)]x100%

比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长影响。订购多量同一批号优良血清，置于–70℃保留之深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第15页基础篇-细胞传代培养1.细胞生长至高密度时，即须分殖至新培养瓶中，普通稀释百分比为1:3至1:6，依细胞种类而异。

2.材料：

2.1.无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010)

2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：

以10ml分装于15ml无菌离心管中，保留于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。

2.3.新鲜培养基

2.4.无菌吸管/离心管/培养瓶

3.步骤：

3.1.附着型胞(adherentcell)

3.1.1.吸掉旧培养液。

3.1.2.用D-PBS洗涤细胞一至二次。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第16页3.1.3.加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而展现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。)

3.1.4.轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释百分比转移至新培养瓶中，以正常培养条件培养。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第17页3.2.悬浮型细胞(suspensioncell)

3.2.1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

3.2.2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释百分比转移至新培养瓶中，以正常培养条件培养。

3.3.融合瘤(hybridoma)

3.3.1.有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。所以继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第18页基础篇-细胞冷冻保留（一）1.注意事项：

1.1.欲冷冻保留之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80–90％致密度。

1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，比如hybridoma应在冷冻保留前一至二日测试是否有抗体之产生。

1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购置无菌产品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小体积分装，4℃避光保留，勿作屡次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保留。在开启后一年内使用，因长久储存后对细胞会有毒性。1.4.冷冻保留之细胞浓度：

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第19页1.4.1.normalhumanfibroblast:1~3x106cells/ml

1.4.2.hybridoma:1~3x106cells/ml，细胞浓度不要太高，一些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

1.4.3.adherenttumorlines:5~7x106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3x106cells/ml。

1.4.4.othersuspensions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte须最少5x106cells/ml。

1.5.冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保留之同时，亦应作一个backupculture，以预防冷冻失败。1.6.冷冻方法：

1.6.1.传统方法:4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16-18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长久储存。

1.6.2.程序降温：利用等速降温机以–1～-3℃/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vaporphase长久储存。适合用于悬浮型细胞与hybridoma之保留。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第20页基础篇-细胞冷冻保留（二）2.材料：

2.1.生长良好之培养细胞

2.2.新鲜培养基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.无菌塑料冷冻保留管(Nalgene5000-0020)

2.5.0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

2.6.血球计数盘与盖玻片

2.7.等速降温机(KRYO10SeriesII)

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第21页3.步骤：

3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

3.2.配制冷冻保留溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最终浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。

3.3.依细胞继代培养之操作，搜集培养之细胞，取少许细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保留溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保留管中，1ml/vial，并取少许细胞悬浮液作污染检测。

3.5.冷冻保留方法1:冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长久储存。

3.6.冷冻保留方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为:program7:HBCELL深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第22页基础篇-冷冻细胞活化1.冷冻细胞之活化标准为快速解冻，以防止冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，造成细胞之死亡。

2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特征表现才会恢复正常(比如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3.材料

37℃恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/离心管/培养瓶，液氮或干冰容器

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第23页4.步骤：

4.1操作人员应戴防护面罩及手套，预防冷冻管可能爆裂之伤害。

4.2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检验盖子是否旋紧，因为热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

4.3将新鲜培养基置于37°C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

4.4取出冷冻管，马上放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%ethanol擦拭保留管外部，移入无菌操作台内。

4.5取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释百分比1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

4.6解冻后是否马上去除冷冻保护剂(比如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，普通而言，大都不需要马上去除冷冻保护剂。惟若要马上去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

4.7若不需马上去除冷冻保留剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第24页基础篇-收到细胞处理方式(一)1.收到细胞株包裹时，请检验细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请马上通知。细胞株请尽速开始培养，或马上冷冻保留(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。

2.冷冻细胞解冻程序:

2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和百分比，制备培养基。绝大多数之细胞均无法马上适应不一样之基础培养基或不一样之血清种类，若因试验需要，必须有所不一样时，务必以迟缓百分比渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，方进行所需之试验。

2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第25页2.3.将培养基置于37°C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，马上放入37°C水槽中快速解冻，水面高度不可靠近或高过冷冻管之盖沿，不然易发生污染。轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化后，以70%ethanol擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。

2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10ml培养基加至T25或T75flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25或T75flask内之培养基，混合均匀，放入37°C，5%CO2培养箱培养。

2.5.对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO敏感或会造成细胞分化之细胞，需马上去除DMSO者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5-10ml培养基中，离心300xg(约1000rpm)，5分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37°C，5%CO2培养箱培养。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第26页基础篇-收到细胞处理方式(二)收到T25flask细胞时，处理方式为︰

1.于寄送过程中，为防止起泡造成细胞脱落死亡，T25flask均加满培养基。请检验flask外观，并于显微镜下观察细胞生长情况和有没有污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请马上通知细胞试验室。

2.将原封之T25flask静置于37°C，5%CO2培养箱中，使细胞回温至37°C，并让运输过程中少数脱落细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基能够再使用)，仅留约5-10ml培养基于flask内，依普通培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第27页附-细胞计数与存活测试（一）1.原理：

1.1.计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

1.2.血球计数盘普通有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

1.3.存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗透死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗透而不会呈色。普通使用蓝色之trypanblue染料，假如细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第28页附-细胞计数与存活测试（二）2.材料：

0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

Erythosinbluishstain

取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethyl

paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline

血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)，计数器(counter)，低倍倒立显微镜

粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)

3.步骤：

3.1.取50ml细胞悬浮液与50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

3.2.取少许混合液(约15ml)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。

3.3.计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(最少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最终乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

4大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml

*每一大格体积=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第29页3.4.若不用血球计数盘，可用Coultercounter作自动计数，惟无法区分死细胞或活细胞。

3.5.范例：

T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55,62,49,59

死细胞数/方格：5,3,4,6

细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75

稀释倍数=2

细胞数/ml：60.75x104x2=1.22x106

细胞数/flask：1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：225/243﹦92.6%深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第30页升级篇-细胞培养11冷冻管应怎样解冻？

取出冷冻管后，须马上放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超出冷冻管盖沿，不然易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。2细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？

除少数尤其注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包含悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可防止大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第31页3可否使用与原先培养条件不一样之培养基？

不能。每一细胞株都有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不一样之培养基，细胞大都无法马上适应，造成细胞无法存活。4可否使用与原先培养条件不一样之血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为主要营养起源，所以血清种类和品质对于细胞生长会产生极大影响。来自不一样物种血清，在一些物质或分子量或内容物上都有所不一样，血清使用错误常会造成细胞无法存活。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第32页升级篇-细胞培养25何谓FBS,FCS,CS,HS?

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同意思，二者都是指胎牛血清，FCS乃错误使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。6培养细胞时应使用5%或10%CO2？或根本没有影响？

普通培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH缓冲系统，而培养基中NaHCO3含量将决定细胞培养时应使用CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第33页7何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

8培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，普通正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。9附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应怎样处理？

普通使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应马上少许分装于无菌试管中，保留于–20°C，防止重复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可降低污染之机会。10悬浮性细胞应怎样继代处理？

普通仅需连续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第34页升级篇-细胞培养311欲将普通动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率普通为300xg(约1,000rpm)，5-10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。12细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之百分比接种即可。细胞数太少或稀释太多亦是造成细胞无法生长之一主要原因。13细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保留时最常使用冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：因为DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第35页14DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保留使用之DMSO等级，必须为Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即为无菌情况，第一次开瓶后应马上少许分装于无菌试管中，保留于4°C，防止重复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可降低污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。15冷冻保留细胞之方法？

冷冻保留方法一:冷冻管置于4°C30~60分钟→(-20°C30分钟*)→-80°C16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长久储存。

冷冻保留方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase长久储存。*-20°C不可超出1小时，以预防冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第36页升级篇-细胞培养416细胞欲冷冻保留时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目普通为1x106cells/mlvial，融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜。17应怎样防止细胞污染？细胞污染种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要污染原因为无菌操作技术不妥、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁环境、与品质良好之细胞起源和培养基配制是减低污染之最好方法。18假如细胞发生微生物污染时，应怎样处理？

加入对应抗生素。直接灭菌后丢弃之。19支原体(mycoplasma)污染细胞，是否能以肉眼观察出异状？

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第37页不能。除极有经验之教授外，大多数遭受支原体污染细胞株，无法以其外观分辨之。20支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响全部细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行试验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，试验结果之数据方有意义。21侦测出细胞株有支原体污染时，该怎样处理？

直接灭菌后丢弃，以防止污染其它细胞株。22CO2培养箱之水盘怎样保持清洁？

定时(最少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第38页升级篇-细胞培养523为何培养基保留于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？

培养基保留于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐步溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，能够通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。24各种细胞培养用dish，flask是否均相同？

不一样厂牌dish或flask，其所coatingpolymer不一样，制造程序亦不一样，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不一样之dish或flask而有显著之生长差异。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第39页25购置之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上失误，造成细胞物理性损伤，以及细胞流失。提议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。26购置之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。27收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不妥，造成冷冻管裂损，提议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能所以而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第40页升级篇-细胞培养628怎样选取特殊细胞系培养基？

培养某一类型细胞没有固定培养条件。在MEM中培养细胞，很可能在DMEM或M199中一样很轻易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好开始，各种目标无血清培养最好首选AIMV（1）培养基（SFM）。

29L-谷氨酰胺在细胞培养中主要吗？它在溶液中不稳定吗？

L-谷氨酰胺在细胞培养时是主要。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞能量起源、参加蛋白质合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，不过确切降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺降解造成氨形成，而氨对于一些细胞含有毒性。

深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第41页30GlutaMAX-I是什么？培养细胞怎样利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺衍生物，其不稳定alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一个肽酶逐步裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小降解，假如在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

31什么培养基中能够省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为PH值指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红能够模拟固醇类激素作用，（尤其是雌激素）。为防止固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红培养基。因为酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红培养基。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第42页升级篇-细胞培养732培养基中丙酮酸钠作用是什么？

丙酮酸钠能够作为细胞培养中替换碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，不过，假如没有葡萄糖话，细胞也能够代谢丙酮酸钠。

34二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA目标是什么？

二价离子确实抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离镁离子和钙离子，方便保持抑制胰蛋白酶活性。提议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中全部二价离子。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第43页33目录上说，Hank‘s平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s平衡盐溶液(HBS)和Earle‘s平衡盐溶液(EBS)有什么本质功效差异？

HBS和EBS主要差异在于碳酸氢钠水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平CO2平衡，以维持溶液PH值。Eagles液在空气水平CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。假如希望在CO2培养箱中保留组织，需要用Eagles液，。假如仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存组织，用Hanks液就能够了。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第44页升级篇-细胞培养835当在无血清培养基中添加抗生素时，降低最少在有血清培养基中所使用浓度50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞到达毒性水平。

36一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中基本成份在解冻后就开始降解。

37大部分添加物和试剂最多能够冻融3次，假如次数更多都会在包含蛋白溶液引发一定水平降解和沉淀，将会影响它性能。

38在溶解一周内使用贮存在4℃冰箱中液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，假如在室温下放置超出30分钟，就会变得不稳定。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第45页细胞分离试剂（1）大部分连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞HBSS或无钙镁PBS0.25％胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中细胞表面蛋白完整性主要连续细胞系HBSS或无钙镁PBS0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mMEDTA弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞（要求细胞表面完整性），原代细胞HBSS或无钙镁PBSEDTA,甘油溶解在柠檬酸钠中强贴壁早代细胞系HBSS或无钙镁PBS0.25％胰蛋白酶溶解在1mMEDTA，Dispase0.6-2.4单位/ml溶解在PBS深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第46页细胞分离试剂（2）上皮细胞0.5mM-1mMEDTA0.5mM-1mMEDTA，Dispase0.6-2.4单位/ml溶解在PBS强贴壁细胞，上皮细胞，一些肿瘤细胞0.5mM-1mMEDTA0.25％胰蛋白酶1mMEDTA，Dispase0.6-2.4单位/ml溶解在无钙镁PBS厚培养物，多层富含胶原密集培养1mMEDTA0.25％胰蛋白酶，200单位/ml胶原酶，1mMEDTA溶解在无钙镁平衡盐溶液中深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第47页培养液pH值改变太快CO2张力不对。培养瓶盖拧得太紧。NaHCO3缓冲系统缓冲力不足。培养液中盐浓度不正确。细菌、酵母或真菌污染。（1）按培养液中NaHCO3浓度增加或降低培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。（2）改用不依赖CO2培养液。松开瓶盖1/4圈。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制培养液。丢弃培养物或用抗生素除菌。深度优化纯净版细胞培养中的细节问题专家讲座第48页培养液出现沉淀，但pH值不变用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成份沉淀下来。冰冻保留培养液。用去离子水重复冲洗玻璃器皿，然后除菌。将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀依然存在，丢弃培养液