基因诊疗与基因治疗专家讲座

基因诊疗与基因治疗

GeneDiagnosisandGeneTherapy第二十八章基因诊疗与基因治疗第1页第一节基因诊疗学基础第二节遗传病基因诊疗第三节肿瘤基因诊疗第四节基因诊疗在法医学上应用

第五节基因治疗概念及策略

本章内容提要基因诊疗与基因治疗第2页第一节

基因诊疗学基础

BasisofGeneDiagnostics基因诊疗与基因治疗第3页基因诊疗之父—简悦威1976年加州大学华裔科学家KanYW用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊疗。基因诊疗与基因治疗第4页一、基因诊疗概念、特点及临床意义

定义：利用分子生物学技术，经过检测基因及基因表示产物存在状态，对人体疾病作出诊疗方法。

基因诊疗检测目标分子是DNA、RNA，也能够是蛋白质或者多肽。

基因诊疗与基因治疗第5页诊疗依据(遗传物质改变)DNA、RNA或蛋白质水平改变，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表示水平从低到高；基因结构改变，如点突变引发基因失活、染色体转位引发基因异常激活或灭活。基因诊疗与基因治疗第6页基因诊疗特点高特异性高灵敏性早期诊疗性应用广泛性基因诊疗与基因治疗第7页二、基因诊疗中惯用分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印迹（Westernblotting）免疫组织化学诊疗基因诊疗与基因治疗第8页（三）单链构象多态性分析

（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）

DNA突变造成DNA片段碱基序列不一样，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中构象不一样（单链构象多态性），利用迁移率差异可使各种序列不一样单链分离开来。基因诊疗与基因治疗第9页PCR-SSCP分析原理示意基因诊疗与基因治疗第10页正常人纯合突变杂合突变+PCR-SSCP分析

－基因诊疗与基因治疗第11页基因诊疗中惯用分子生物学方法比较方法特点核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐PCR灵敏度、特异性高SSCP操作简便、检出率不高RFLP结果可靠但限制较多DNA测序可自动化生物芯片效率高，成本高基因诊疗与基因治疗第12页三、基因诊疗技术路线与方法

直接诊疗：直接分析致病基因分子结构及表示是否异常间接诊疗：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析依据对致病基因或相关基因了解程度决定基因诊疗技术路径选择。基因诊疗与基因治疗第13页（一）直接诊疗路径

必要条件：◆被检测基因改变与疾病发生有直接因果关系◆被检基因正常分子结构已被确定◆被检基因致病分子机制（突变位点或表示改变）已知基因诊疗与基因治疗第14页5/——5/—3/3/—RFLP1.点突变检测

（1）有限制性内切酶位点改变基因诊疗与基因治疗第15页斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序5/——5/—3/3/—（2）无限制性酶切位点改变

基因诊疗与基因治疗第16页

在DNA序列上有一段较长序列重新排布。包含数十个碱基到数千个碱基丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包含染色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。

2.基因重排检测核酸分子探针杂交与PCR基因诊疗与基因治疗第17页3.基因表示异常检测

mRNA相对定量分析mRNA绝对定量分析

mRNA长度分析基因诊疗与基因治疗第18页（二）间接诊疗路径1.采取原因致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病位点不便检测基因诊疗与基因治疗第19页

DNA多态性：指群体中DNA分子存在最少两种不一样类型，即个体间同一染色体相同位置上核苷酸序列存在一定差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与一些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.遗传标识基因诊疗与基因治疗第20页间接诊疗：检测与致病基因连锁遗传标识三代遗传标识：

RFLP（基于核酸分子杂交技术）

VNTR(variablenumberoftandemrepeats);

STR(shorttandemrepeats)

SNP(singlenucleotidepolymorphism)基因诊疗与基因治疗第21页第五节

基因治疗概念及策略

ConceptandStrategyofGeneTherapy基因诊疗与基因治疗第22页定义：

经过在特定靶细胞中表示该细胞原来不表示基因，或采取特定方式关闭、抑制异常表示基因，到达治疗疾病目标治疗方法。基因诊疗与基因治疗第23页本节内容提要

一、基因治疗策略

二、基因转移技术

三、基因干预

四、基因治疗应用研究

五、基因治疗前景与问题基因诊疗与基因治疗第24页一、基因治疗策略基因诊疗与基因治疗第25页

（一）基因置换（genereplacement）

定义：指将特定目标基因导入特定细胞，经过定位重组，导入正常基因，以置换基因组内原有缺点基因。目标：将缺点基因异常序列进行桥正。对缺点基因缺点部位进行准确原位修复，不包括基因组任何改变。基因诊疗与基因治疗第26页（二）基因添加（geneaugmentation）

定义:

经过导入外源基因使靶细胞表示其本身不表示基因。类型:在有缺点基因细胞中导入对应正常基因，而细胞内缺点基因并未除去，经过导入正常基因表示产物，赔偿缺点基因功效；向靶细胞中导入靶细胞原来不表示基因，利用其表示产物到达治疗疾病目标。基因诊疗与基因治疗第27页（三）基因干预（geneinterference）

定义：采取特定方式抑制某个基因表示，或者经过破坏某个基因结构而使之不能表示，以到达治疗疾病目标。基因诊疗与基因治疗第28页定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码酶能使无毒性药品前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而到达去除肿瘤细胞目标。应用：是恶性肿瘤基因治疗主要方法之一。（四）自杀基因治疗(SuicideGeneTherapy)基因诊疗与基因治疗第29页自杀基因作用机制

基因诊疗与基因治疗第30页（五）基因免疫治疗经过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌免疫反应。基因诊疗与基因治疗第31页二、基因转移技术

基因诊疗与基因治疗第32页基因治疗两种路径载体目标基因invivoexvivo靶细胞基因诊疗与基因治疗第33页

基因转移(genetransfer)技术

1.病毒介导基因转移2.非病毒介导基因转移基因诊疗与基因治疗第34页

1.病毒介导基因转移系统病毒载体介导基因转移效率较高，所以它也是使用最多基因治疗载体。据统计，有72%临床试验计划和71%病例使用了病毒载体，其中用得最多是反转录病毒载体。基因诊疗与基因治疗第35页反转录病毒结构及生活周期（1）反转录病毒

基因诊疗与基因治疗第36页反转录病毒介导基因转移系统

——由两部分组成反转录病毒载体：其基因组为缺点型，保留了病毒包装信号ψ，而缺失病毒包装蛋白基因.辅助细胞株：能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。

基因诊疗与基因治疗第37页Retroviralpackagingsystem基因诊疗与基因治疗第38页

（2）腺病毒(adenovirus)载体

腺病毒是一个大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它经过受体介导内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

基因诊疗与基因治疗第39页腺病毒优点基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导与细胞分裂无关；重组腺病毒可经过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因。基因诊疗与基因治疗第40页

2.非病毒载体介导基因转移系统

（1）脂质体介导基因转移技术脂质体介导基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，能够自动形成包埋外源DNA脂质体，然后与细胞一起孵育，即可经过细胞内吞作用将外源DNA（即目标基因）转移至细胞内，并进行表示。

基因诊疗与基因治疗第41页脂质体介导基因转移示意图基因诊疗与基因治疗第42页

（2）受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性配体偶联，可使DNA含有靶向性。

多聚阳离子与配体共价连接后，又经过电荷相互作用与带负电荷DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这么形成复合物可被带有特异性受体靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。基因诊疗与基因治疗第43页受体介导转移技术示意图基因诊疗与基因治疗第44页

（3）基因直接注射技术

不需要进行基因工程繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或一些器官组织内。动物试验表明：接收注射外源DNA小鼠能够按其基因编码合成对应蛋白质，并能维持数月之久。

将促进心脏血管生长基因直接注入试验鼠心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺乏胰岛素；肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需凝血因子Ⅸ。基因诊疗与基因治疗第45页三、基因干预

（geneinterference）

基因诊疗与基因治疗第46页（一）反义RNA（antisenseRNA）

1.反义RNA与基因表示调控利用反义RNA对体外培养细胞进行基因表示调控，通常采取方法有两种：

（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义RNA重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。基因诊疗与基因治疗第47页2.受体介导反义RNA转移技术①受体介导RNA转移十分专一，而且效率高；②被转移RNA是被保护，与周围环境之间存在多聚赖氨酸保护层,能够抵抗环境中核酸酶降解作用。借助前述受体介导基因转移方法，能够实现受体介导反义RNA转移。基因诊疗与基因治疗第48页（二）核酶(ribozyme)

在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断，经过破坏靶RNA分子而到达治疗疾病目标。

基因诊疗与基因治疗第49页

1.核酶设计（1）选择适当靶部位，该部位含有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2）核酶基本组成：用于基因治疗核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。基因诊疗与基因治疗第50页核酶作用机制

基因诊疗与基因治疗第51页

2.核酶应用与普通反义RNA相比，核酶含有较稳定空间结构，不易受到RNA酶攻击。更主要是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它mRNA分子。

基因诊疗与基因治疗第52页（三）RNA干扰

1.RNA干扰现象RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一个由双链RNA诱发基因缄默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因表示。基因诊疗与基因治疗第53页RNA干扰机制示意图基因诊疗与基因治疗第54页四、基因治疗应用研究

基因诊疗与基因治疗第55页（一）遗传病基因治疗研究

(一)遗传病基因治疗必须符合以下要求1.在DNA水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因表示不需要准确调控；4.该基因能在一个便于临床操作组织细胞中表示并发挥其生理作用；5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求不过只有30余种遗传病。基因诊疗与基因治疗第56页腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)