基因工程原理与技术

基因工程原理与技术基因工程原理与技术第1页第一章绪论第一节基因工程概念基因工程(geneengineering)是当代生物技术关键内容。

基因工程是在分子水平上进行遗传操作，是指将一个或各种生物体基因分离出来或人工合成基因，按照大家愿望，进行严密设计和体外加工重组，转移到另一个生物体细胞内，使之能在受体细胞中遗传表示并取得新遗传性状而形成新生物类型生物技术。

基因工程关键内容是基因体外重组(DNA体外重组)。基因工程四大要素(或基础条件)：目标基因、载体、工具酶、受体。

相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。基因工程突出特点：打破物种间基因交流界限。

基因工程原理与技术第2页第二节基因工程诞生与发展

基因工程诞生于1973年。一、基因工程诞生理论和技术基础1、理论基础

①DNA是遗传物质；

②DNA分子双螺旋结构和半保留复制；

③遗传密码通用性和遗传信息传递方式。2、技术基础

①限制性核酸内切酶发觉与DNA切割；

②DNA连接酶发觉与DNA片段连接；

③基因工程载体构建与应用。

基因工程原理与技术第3页二、基因工程诞生

1972年，美国斯坦福大学P.Berg研究小组DNA体外重组试验。

1973年，斯坦福大学S.Cohen研究小组DNA体外重组和大肠杆菌转化试验。(见下两张幻灯片)

同年，加利福尼亚大学H.Boyer也进行了类似试验。这一试验成功标志着基因工程诞生，所以，1973年被定为基因工程诞生元年。

基因工程原理与技术第4页pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因基因工程原理与技术第5页培养平皿

卡那霉素平板四环素\卡那霉素平板大肠杆菌四环素平板基因工程原理与技术第6页三、基因工程发展

分为艰难阶段、逐步成熟阶段、快速发展阶段、鼎盛发展阶段。1、基因工程艰难阶段(1973~1976，载体和受体系统安全性改造)

基因工程安全性问题，造成许多国家限制基因重组试验。2、基因工程逐步成熟阶段(1976~1982，基因工程药品研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)企业成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先将人工合成生长激素释放抑制因子14肽基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽(见下列图)；

1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表示成功；

1979年美国基因技术企业用人工合成人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中，并经过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业化序幕。

基因工程原理与技术第7页大肠杆菌生长激素释放抑制因子重组体+SS基因目标基因基因载体从动物脑中提取5mg---50万只羊脑9升工程大肠杆菌培养液基因工程原理与技术第8页3、基因工程快速发展阶段(1982~，动植物基因工程育种与基因治疗)

发展了一系列新基因工程操作技术，构建了各种转化原核生物和动物、植物细胞载体。

1982年首次经过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠。

1983年采取农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。

1990年美国政府首次同意一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺点而患有重度联合免疫缺点症儿童进行基因治疗取得成功。

1991年，美国提出人类基因组计划并实施。基因工程原理与技术第9页4、鼎盛发展阶段(21世纪)

年完成人类基因组计划。至今，基因工程药品上市有几十种，上百种正在进行临床试验。

转基因植物快速发展，当前最少有150种转基因植物问世。自从1986年抗除草剂转基因烟草被首次同意进入田间试验以来,至今国际上已经有30个国家同意上千例转基因植物进入田间试验,包括植物种类达50各种。自从1994年转基因延熟西红柿获准上市以来，当前最少有51种转基因植物上市。

基因工程原理与技术第10页

即使转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。荷兰GenPharm企业用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉销售额是50亿美元。基因工程原理与技术第11页

英国罗斯林研究所研制成功转基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人α[1]-抗胰蛋白酶做替换疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。基因工程原理与技术第12页

中国工程院院士曾溢涛教授研究小组取得5只转基因山羊。其中一只奶山羊乳汁中，含有堪称血友病人救星药品蛋白——有活性人凝血因子Ⅸ。

基因工程原理与技术第13页第三节基因工程研究主要内容一、基因工程研究主要内容主要包含：基础研究（载体研究、受体系统研究、目标基因研究、工具酶研究、转化方法研究、生物基因组学研究）和应用研究等。1、载体研究构建各种用途载体及提升外源基因表示效率。2、受体系统研究

包含细菌、真菌、植物、动物。

受体系统安全性及转化效率。3、目标基因研究目标基因分离、克隆及改造。

基因工程原理与技术第14页4、工具酶研究开发新工具酶。5、转化方法研究开发各种受体细胞高效转化方法。6、生物基因组学研究含有主要经济价值各种生物基因组测序、挖掘新基因等。7、应用研究

包含基因工程药品研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等方面应用。

基因工程原理与技术第15页二、基因工程基础操作程序

①分离取得带有目标基因DNA片段及载体选择与构建。

②限制性核酸内切酶分别切割外源DNA和载体。

③经过DNA连接酶将外源基因DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子。

④将重组DNA分子引入到受体细胞(转化)。

⑤带有重组体细胞(转化体)扩增及选择培养。

⑥转化体判定，取得外源基因高效稳定表示基因工程菌或细胞。⑦目标基因深入研究分析，并设法使之实现功效蛋白表示(基因功效研究或基因改造研究)。

基因工程原理与技术第16页基因工程原理与技术第17页三、基因工程基础操作内容基因工程主体战略思想是外源基因稳定高效表示。为到达此目标，可从以下几个方面进行操作。

①选取高拷贝载体，增加外源基因在受体细胞中剂量；②筛选、修饰和重组开启子、增强子、终止子等基因转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接，强化外源基因转录水平。③选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质生物合成过程。

④构建融合表示载体或分泌表示载体，增加外源蛋白可溶性。

基因工程原理与技术第18页第四节基因工程意义与发展前景一、基因工程研究意义①大规模生产其它生物体内含量极微但却含有较高经济价值生物分子；②设计构建新物种(新性状乃至全新物种

)；③搜寻、分离和判定生物体尤其是人体内遗传信息资源(基因)。二、基因工程发展前景基因工程问世以来短短三十年，显示出了巨大活力，基因工程前景将愈加灿烂辉煌。今后，基因工程重点研究方向是基因组学、基因工程药品、动植物生物反应器和环境保护等方面。

基因工程原理与技术第19页第二章基因工程工具酶

工具酶是指基因工程操作中所使用核酸酶类。依据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。第一节限制性核酸内切酶一、宿主限制-修饰现象(见下列图)

限制作用(restriction)：指一定类型细菌能够经过限制酶作用，破坏入侵噬菌体DNA，造成噬菌体寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定保护机制。

修饰作用(modification)：指寄主本身DNA，因为在合成后经过甲基化酶作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭本身限制性酶破坏。这是宿主细胞识别本身遗传物质和外来遗传物质作用机制。基因工程原理与技术第20页R/M系统①DNA甲基化酶②限制性核酸内切酶R/M系统作用①限制作用②修饰作用基因工程原理与技术第21页1953年，Arber发觉限制-修饰现象，预见限制性核酸内切酶存在；

1970年，H.O.Smith从流感嗜血杆菌中分离出第一个II型限制性核酸内切酶HindII。

Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA。基因工程原理与技术第22页基因工程原理与技术第23页

依据限制-修饰系统遗传分析，大肠杆菌K12有以下4种表型：①rk+mk+：野生型，含有完整限制和修饰功效。②rk-mk+：限制缺点型，不能降解外源DNA，但含有修饰功效，这类突变株经常见于基因工程受体。③rk-mk-：限制和修饰缺点型，既无限制功效，又无修饰功效，也常见于基因工程受体。④rk+mk-：修饰缺点型，缺乏修饰本身DNA功效，但含有限制功效，故也称为“自杀性表型”(suicidephenotype)。基因工程原理与技术第24页二、限制性核酸内切酶类型

限制性核酸内切酶是指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA核酸内切酶。

简称限制性内切酶或限制性酶，当前已经判定出三种不一样类型。至今，已发觉近4000种限制酶。特征Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子结构功效辅助因子识别序列切割位点切割方式应用价值举例异源三聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列距识别序列1kb处随机性切割无EcoK、EcoB同源三聚体限制Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割广泛EcoRI、HindIII…异源二聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列识别序列下游24-26bp处随机性切割小EcoPI基因工程原理与技术第25页三、限制性核酸内切酶命名

1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系统，1980年Roberts在此基础上进行了修改。①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。②第四个字母代表宿主菌菌株名第一个字母(小写，正体)或染色体外成份(质粒或噬菌体，大写，正体)。③若从一个菌株中发觉了几个限制性核酸内切酶，即依据发觉和分离先后次序用罗马字母表示(正体)。

Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血杆菌d株

HindⅡ

HindⅢ基因工程原理与技术第26页四、II型限制性核酸内切酶基础特征1、II型限制性内切酶识别序列

普通为4～6bp回文序列。也有6bp以上，如NotI，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列(间断回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如HindII可识别4种核苷酸序列。

酶识别序列酶识别序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG基因工程原理与技术第27页2、II型限制性核酸内切酶切割方式大多数II型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团片段。有三种切割方式：①在识别序列对称轴5’末端切割，产生5’黏性末端，如EcoRI基因工程原理与技术第28页②在识别序列对称轴3’端切割，则产生3’黏性末端，如PstI基因工程原理与技术第29页③在识别序列对称轴上切割，产生平头末端，如PvuII

有些识别序列为间断型回文序列II限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGC

SfiIGGCCNNNNN↓NGGCC

XmnIGAANN↓NNTTC基因工程原理与技术第30页

有极少数II型限制性核酸内切酶切割位点远离识别序列，如MboII识别GAAGA序列，切割位点则是：

5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’

同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不一样、起源不一样II限制性核酸内切酶。如：HpaII与MspI识别序列和切割位点都相同(C↓CGG)，但MspI还能够识别已甲基化序列CmCGG；

SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，识别序列相同，但切割位点不一样。基因工程原理与技术第31页

同尾酶是指起源各异、识别序列不一样，但产生相同黏性末端II限制性核酸内切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)

BglII(5’-A↓GATCT-3’)3、II型限制性核酸内功酶不含有甲基化功效如EcoRI限制性核酸内切酶与EcoRI甲基化酶，二者均识别GAATTC序列，而前者能对G↓AATTC序列进行切割，后者作用是使第二个A甲基化。当前已经分离到许多II型限制性核酸内切酶与其对应甲基化酶。基因工程原理与技术第32页4、II型限制性核酸内切酶对单链DNA切割有一些II限制性核酸内切酶，除双链DNA外，还能够特异识别并切割单链DNA对应位点，只是切割效率比较低。如HhaI能切割单链噬菌体ФX174和M13mp18DNA，只是切割单链DNA比切割双链DNA效率低50％。五、Ⅱ限制性核酸内切酶主要用途①产生含有相同粘性末端DNA片段，方便重组克隆；②建立DNA分子限制酶图谱；③构建基因文库；④构建载体。基因工程原理与技术第33页六、II型限制性核酸内切酶酶切反应1、标准酶解体系建立

反应体积普通为20μl(依据DNA量可适当扩充)。

①10×酶切缓冲液

2μl(大个别酶反应缓冲液基础相同：

50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(依据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超出反应总体积10％

③DNA样品(μ

g~mg)④无菌水

限制性核酸内切酶一个活力单位(U)为：在适当温度和缓冲液中，在20μ

L反应体系中，1h完全降解1ug标准DNA所需要酶量。基因工程原理与技术第34页2、酶解反应①混匀②酶解(温度、时间)③酶解判定④终止a、加EDTA至10mmol/L；

b、加SDS至0.1%(W/V)；

c、65℃水浴保温20min(有些最适反应温度较高酶不能使之完全失活，如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；

d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA

3、限制性核酸内切酶对DNA不完全酶解(见下列图)

不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要。其方法有降低酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。

基因工程原理与技术第35页incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+3基因工程原理与技术第36页4、Ⅱ限制性核酸内切酶操作注意事项①商品化限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新吸头去取酶；②加入酶体积应不超出总体积10%，不然酶液中甘油浓度超出5%时将会抑制酶活性；③整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最终加入酶；④尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水；⑤当切割大量DNA时，通常采取延长反应时间，降低酶用量；⑥当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。基因工程原理与技术第37页七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果原因

1、酶纯度；要求不存在其它核酸内切酶或外切酶污染。

2、DNA样品纯度；

DNA样品中蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。样品中DNase会降解DNA，影响酶切。3、酶切反应温度、时间；多数II型限制酶最适反应温度是37℃，但SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃，TaqI为65℃

。反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至造成酶失活。基因工程原理与技术第38页4、DNA甲基化程度；限制性核酸内切酶不能切割甲基化核苷酸序列。这一特征有特殊用途：①改变一些限制性核酸内切酶识别序列；②产生新限制酶识别序列；③保护限制性核酸内切酶切点；④利用一些同裂酶对甲基化敏感性不一样，研究细胞DNA位点专一性甲基化程度和分布。

大肠杆菌中DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌中DNA胞嘧啶甲基化酶

(dcm)在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。采取去甲基化酶大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可预防DNA甲基化。基因工程原理与技术第39页5、DNA分子构型

限制性内切酶对不一样构型DNA分子酶切效果是不一样，比如超螺旋DNA酶解所需要酶量，比线性DNA酶解所需要酶量高许多，甚至可高达20倍。有些限制性核酸内切酶对于同一DNA分子上不一样位置识别序列，切割效率显著不一样。比如，EcoR

I、HindIII对λDNA酶切。6、反应缓冲液主要成份：pH(Tris-HCl)、离子强度(NaCl)、Mg2+；

辅助成份：β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)预防酶氧化；

牛血清蛋白(BSA)组分V对于一些酶是必需，可预防酶在低浓度蛋白质溶液中变性。基因工程原理与技术第40页

星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相同序列特征。

比如EcoRI在高pH(＞8)、低盐(50mmol/L)和高浓度甘油(＞5％)存在情况下，其识别序列由GAATTC改变为NAATTN。以EcoRI

表示其星号活性。

引发星号活性原因有：①高甘油含量，大于5%；②酶用量过大，大于100U/微克DNA；③低离子强度，小于25mmol/L；④高pH，大于8.0；⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+二价阳离子存在。常发生星活性内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。基因工程原理与技术第41页第二节DNA连接酶

1967年几个试验室几乎同时发觉DNA连接酶。一、定义与反应机理

DNA连接酶是指能催化双链DNA分子内或分子间5’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连接一类酶。大肠杆菌和其它细菌：NAD+动物细胞和噬菌体：ATP基因工程原理与技术第42页T4DNA连接酶连接DNA/RNA杂合分子中DNA链切口DNA连接酶无连接基因工程原理与技术第43页DNA连接酶作用机理基因工程原理与技术第44页二、DNA连接酶种类1、T4噬菌体DNA连接酶(T4DNA连接酶)

T4DNA连接酶DNA/RNARNA

平头末端Km比黏性末端Km高约1000倍。提升平头末端连接效率方法：①加大酶浓度(10~100倍于粘性末端)；②加大底物浓度；③加入适量一价阳离子(150-200mmol/LNaCl)；④加入低浓度PEG(10%PEG8000)。ATP最适终浓度为0.5mmol/L。基因工程原理与技术第45页2、大肠杆菌DNA连接酶

E.coliDNA连接酶DNA/RNAE.coliDNA连接酶无连接3、T4噬菌体RNA连接酶

用途：RNA末端标识pNpNNNNT4RNA连接酶基因工程原理与技术第46页三、DNA连接酶反应体系

DNA连接酶活性单位较通用是韦氏(Weiss)单位，一个韦氏单位是指在37℃，20min内催化从γ,β-32P-ATP焦磷酸根置换出1nmol32P所需要酶量。

M-L单位：以d(A-T)n作为底物黏性末端连接单位：以λDNA/HindIII片段为底物一个韦氏单位相当于0.2个M-L单位或者60个黏性末端连接单位。

反应体系：10μL或20μL，DNA片段，连接酶，Buffer，温度(12~16℃或<30℃)，时间(4~16h)

Buffer：50mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/LATP，5mmol/LDTT基因工程原理与技术第47页四、影响连接反应原因1、DNA末端浓度连接产物分子构型(线形或环状)与DNA浓度及DNA分子长度存在亲密关系。在一定浓度下，小分子DNA片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定DNA分子，其浓度增加有利于分子间连接。另外，分子间连接还与两种片段末端浓度百分比相关。标准上一个片段浓度大于另一一个片段浓，如：在克隆中，插入片段:载体片段=2:1。2、反应温度

介于最适温度与其Tm之间。＞30℃会造成T4DNA连接酶不稳定。

3、ATP浓度

ATP最适终浓度为0.5mmol/L，浓度过高会抑制连接。基因工程原理与技术第48页第三节DNA聚合酶

DNA聚合酶分为：①依赖于DNADNA聚合酶；②依赖于RNADNA聚合酶。常见DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、逆转录酶。酶聚合反应速度5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性连续合成能力E.ColiDNA聚合酶I中速有低低Klenow酶中速无低低T4DNA聚合酶中速无高低T7DNA聚合酶快速无高高修饰T7DNA聚合酶快速无低或无高TaqDNA聚合酶快速有无高逆转录酶低速无无中基因工程原理与技术第49页一、大肠杆菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性：双链DNA带磷酸基团5’端或

DNA/RNA杂合分子中RNA5’端3’→5’外切酶活性切口平移作用DNAPolI基因工程原理与技术第50页主要用途：切口平移法制备DNA探针反应体系：在25μl反应体系中含有1μg纯化特定DNA片断，并加入适量DNaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标识dNTPs。

DNaseI，Mg2+PolI，α-32p-dCTP，dNTPs基因工程原理与技术第51页二、Klenow片段

Klenow酶含有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺失5`→3`核酸外切酶活性。其主要用途以下：①补平限制性核酸内切酶产生5’黏性末端；

基因工程原理与技术第52页②标识3’凹陷末端DNA分子或平末端；

DNA末端标识普通标识活性不高，极少用于分子杂交探针标识，主要用于DNA序列测定等所需片段标识。

基因工程原理与技术第53页③合成cDNA第二链；④双脱氧末端终止法测定DNA序列；⑤在单链模板上延伸寡核苷酸引物，以合成杂交探针和进行体外突变。

平末端标识基因工程原理与技术第54页三、T4噬菌体DNA聚合酶

含有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺乏5’→3’外切酶活性。其3’→5’外切酶活性比Klenow酶高100~1000倍。

在无dNTP时，能够从任何3`-OH端外切(即可降解dsDNA，只是其活性比ssDNA低很多)，在只有一个dNTP时，外切至互补核苷酸，在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4DNA聚合酶置换合成作用无dNTP时，T4DNA聚合酶有dNTP时，T4DNA聚合酶基因工程原理与技术第55页T4DNA聚合酶用途：①切平核酸内切酶产生3’黏性末端基因工程原理与技术第56页②末端标识。尤其是不需要核酸外切酶帮助就可进行平末端标识，这种探针标识方法称为置换(取代)合成法。

置换合成法将产生一组末端完全标识、而从末端到中点其标识量递减分子。

基因工程原理与技术第57页四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶

T7DNA聚合酶含有5`→3`聚合酶活性及很强单链、双链DNA3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性。其最大特点是有最强连续合成能力。其用途以下：

①用于长模板(M13DNA)引物延伸；(不受DNA二级结构影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸)②经过延伸或取代合成法标识DNA3’末端；

③将双链DNA5’或3’突出末端转变成平末端结构。对天然T7DNA聚合酶进行修饰，使之降低或完全失去3’→5’外切酶活性，而聚合酶活性增加了3倍。所以，修饰T7DNA聚合酶主要用于双脱氧测序，又称作为测序酶。另外，还用于末端标识、探针制备(可催化较低水平<0.1μmol/LdNTP参入)、体外诱变中DNA链合成。

基因工程原理与技术第58页五、TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶含有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。其最大特点是热稳定(95℃以上高温半小时不失活)，最适反应温度高(70

75℃)。所以，其主要用途是PCR及DNA测序(含有二级结构DNA)。保真PCR酶有TmaDNA聚合酶(Thermotoamaritima

海栖热袍菌)、TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis

海栖热球菌)、PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus

激烈火球菌)、PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesi

沃氏火球菌)。基因工程原理与技术第59页六、逆转录酶①5’→3’聚合酶活性。逆转录酶能以RNA或DNA为模板合成DNA分子，不过后者合成很慢；

基因工程原理与技术第60页②RNA酶H活性。能从5’或3’方向特异地降解DNA/RNA杂交分子中RNA链。

基因工程原理与技术第61页

商品化逆转录酶主要是鸟类骨髓母细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)逆转录酶和Moloney鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，Mo-MLV)逆转录酶。

其用途有：

①合成cDNA第一链，构建cDNA文库；②RT-PCR；③以RNA为模板制备DNA探针；④补平和标识5’-末端突出DNA片段；⑤代替Klenow酶用于DNA序列分析。基因工程原理与技术第62页第四节修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶)

末端转移酶能在二价阳离子作用下，催化DNA聚合作用，但不需要模板，将脱氧核糖核苷酸加到DNA分子3’-OH末端。AAAAAAMg2+dATP末端转移酶效率高Co2+dATP末端转移酶AAAAAAAAAAAAAAAAAAA效率低基因工程原理与技术第63页用途：①给载体和外源DNA(如cDNA或随机切割DNA)接上同聚物尾，方便连接；②末端标识基因工程原理与技术第64页二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脱氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA(一)核糖核酸酶1、核糖核酸酶A(RNaseA)RNaseA是一个内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基3’端磷酸酯键。其反应条件极宽，且极难失活。在低盐浓度(0~100mmol/LNaCl)下，RNaseA切割单链和双链RNA、DNA/RNA中RNA；当NaCl浓度为300mmol/L或更高时，RNaseA就特异性切割单链RNA。

基因工程原理与技术第65页RNaseA用途:①确定RNA或DNA中单碱基突变位置；②经过RNA杂交技术检测特定RNA(特异降解单链RNA，对杂交双链RNA不起作用)，较northern杂交灵敏；③转录起始点及内含子剪接位点分析，其灵敏度比S1核酸酶分析法高数倍；

④降解DNA样品中RNA分子。2、核糖核酸酶T1

RNaseT1也是一个内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上鸟嘌呤残基3’端磷酸酯键。其催化活性与用途类似于RNaseA。基因工程原理与技术第66页3、核糖核酸酶HRNaseH特异地降解DNA/RNA杂交双链中RNA链，产生含有3’-OH和5’-磷酸末端寡核苷酸和单核苷酸，不能降解单链或双链DNA或RNA。

其用途是产生cDNA第二链合成引物。RNaseHPolIdNTPPolIdNTPDNA连接酶基因工程原理与技术第67页(二)

脱氧核糖核酸酶I

DNaseI是一个内切脱氧核糖核酸酶，可从嘧啶核苷酸5’-端磷酸随机降解单链或双链DNA，生成含有5’-磷酸末端寡核苷酸。Mg2+Mn2+用途：①产生大肠杆菌DNA聚合酶I切口平移切口；②在Mn2+存在下，产生构建基因组文库大片段DNA；③DNasel足迹法测定DNA结合蛋白在DNA上准确结合位点；④除去RNA样品中DNA。基因工程原理与技术第68页(三)S1核酸酶作用特点：①需要Zn2+和酸性条件(pH4.0~4.5)；②降解单链DNA或RNA，但降解DNA速度大于降解RNA速度(7倍)；③降解方式为内切和外切，内切为主；④酶量过大时也可降解双链核酸，为单链1/75000。用途：①切掉DNA片段单链突出末端产生平头末端；②在双链cDNA合成时切除发夹环结构；③S1核酸酶作图分析。

如内含子数目、大小、位置分析及转录起始位点与终止位点分析等。

基因工程原理与技术第69页内含子数量及大小分析DNAmRNA分子杂交RERES1核酸酶变性凝胶电泳MABM：分子量MarkerA：未经S1酶处理B：经S1酶处理但不能定位内含子基因工程原理与技术第70页转录起始点定位分析RERERE酶切碱性磷酸酯酶多核苷酸激酶**变性后与mRNA杂交*S1核酸酶*变性凝胶电泳MAB基因工程原理与技术第71页三、核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是一类从多核苷酸链末端开始逐一降解核苷酸酶。

单链核酸