基因表达载体的构建专家讲座

第六章

外源基因在大肠杆菌中表示调控第一节

基因表示概述和基本条件第二节

在大肠杆菌中影响外源基因表示原因基因表达载体的构建专家讲座第1页第一节

基因表示概述和基本条件

一、基因表示基本概念二、基因表示基本条件三、真核基因在原核细胞中表示及调控基因表达载体的构建专家讲座第2页第二节

在大肠杆菌中影响外源基因表示原因一、开启子结构对表示效率影响二、表示载体选择三、外源基因（cDNA）中密码子作用四、mRNA一级结构与基因表示五、mRNA二级结构对翻译起始影响六、mRNA稳定性影响七、转录终止区对外源基因表示效率影响八、转录后若干原因与基因表示关系九、宿主选择对表示影响十、培养条件控制对表示效率影响基因表达载体的构建专家讲座第3页一、基因表示基本概念

生物体遗传信息都是以核苷酸序列编码形式储存在遗传物质DNA上,基因表示是目标基因DNA在导入细胞内转录成mRNA,再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因表示依赖于有效转录和mRNA正确翻译以及翻译后加工处理等各个步骤调整作用，其中转录最为关键，原核基因表示过程和方式与真核细胞有显著不一样。基因表达载体的构建专家讲座第4页二、基因表示基本条件1.外源基因插入序列必须保持正确方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。不然会造成编码错误蛋白质分子，尤其是目标基因序列内部应不含两端酶切位点识别序列。2.插入外源基因必须放在原核开启子控制之下，也就是使原核RNA聚合酶能够识别插入基因。3.外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后mRNA在菌体必须相当稳定，而且能有效地进行翻译，转译蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶降解。

基因表达载体的构建专家讲座第5页三、真核基因在原核细胞中表示及调控真核基因在原核细胞中表示及调控特点㈠有效转录及其调控元件

㈡正确转译

㈢原核表示载体构建基因表达载体的构建专家讲座第6页㈠有效转录及其调控元件

1.RNA聚合酶2.开启子及其转录作用开启（开启子概念、分类）3.转录作用终止4.转录弱化作用基因表达载体的构建专家讲座第7页㈡正确转译

1.起始密码子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）基因表达载体的构建专家讲座第8页㈢原核表示载体构建

原核表示载体构建要求1.表示载体类型2.表示载体举例3.包涵体表示载体基因表达载体的构建专家讲座第9页开启子⑴乳糖开启子（Lac）⑵Trp开启子⑶Tac开启子⑷噬菌体PL和PR开启子⑸脂蛋白开启子（LPP）基因表达载体的构建专家讲座第10页开启子结构对表示效率影响开启子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17bp，大于17bp效果差，不一样产物选取不一样开启子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL开启子效果好。基因表达载体的构建专家讲座第11页表示载体选择载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不一样产物选取不一样类型表示载体。基因表达载体的构建专家讲座第12页外源基因（cDNA）中密码子作用细菌中基因表示对密码子有偏爱性，不偏爱稀有密码子（AGA、AGG）表示效果差，尤其当有AGA-AGG连续序列存在时表示效率低基因表达载体的构建专家讲座第13页mRNA一级结构与基因表示启始密码子：表示效率AUG>GUG>UUGSD序列：较长效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距普通6-12bp，4-10bp较佳，9bp最正确；SD序列5’非翻译区，若有5’-UGAUCU，则有增强作用。基因表达载体的构建专家讲座第14页mRNA二级结构对翻译起始影响mRNA形成二级结构时，可产生茎环。若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受抑制；在茎环外则有利于转译。见表6-1基因表达载体的构建专家讲座第15页mRNA稳定性影响REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子也起保护作用。基因表达载体的构建专家讲座第16页真核基因在原核细胞中表示及调控特点只有一个RNA聚合酶以操纵子为单位来完成基因转录基因转录无RNA剪接功效因无核仁、核膜，核酸均为裸露，转录与翻译是连续进行转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多条肽链有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结合和翻译起始无糖基化功效基因表达载体的构建专家讲座第17页RNA聚合酶原核细胞只有一个RNA聚合酶，当其关键酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识别DNA上开启子进行转录。基因表达载体的构建专家讲座第18页开启子概念开启子是位于结构基因上游，转录起始调控所必需一段DNA序列，内含-35区（与σ因子结合）和-10区（和关键酶结合）保守序列。当开启子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。基因表达载体的构建专家讲座第19页转录作用终止由转录终止子发挥作用，凡能使转录终止相关DNA序列称终止子。强终止子：不依赖ρ因子发挥终止作用，回文序列中G/C配对多，有四个以上U，致使RNA聚合酶构象改变而终止转录。如图6-9,如图6-10弱终止子：依赖ρ因子发挥终止作用。如图6-11基因表达载体的构建专家讲座第20页转录弱化作用转录弱化作用使转录没有抵达终止信号处而中途停顿转录，使mRNA转录发生部分停顿，而不是发生全部停顿。

基因表达载体的构建专家讲座第21页起始密码子起始密码子是编码多肽链第一位氨基酸密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见起始密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表示作用AUG＞GUG。基因表达载体的构建专家讲座第22页核糖体结合位点转录mRNAAUG上游含有，能与核糖体发生有效结合和转译所需要序列（RBS），长度为3-9bp，距AUG3-11bp，它与16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互补其互补程度、SD与AUG间距等与转译效果相关。如图基因表达载体的构建专家讲座第23页表示载体类型表示载体类型主要有四种：非融合型表示载体，如PKK223-3如图6-14分泌型表示载体，如PINⅢ-ompA1如图6-15融合蛋白型表示载体，如PGEX如图6-16包涵体型表示载体，如pBV220如图6-17基因表达载体的构建专家讲座第24页原核表示载体构建要求完整表示载体（质粒）应有强开启子（P）、终止子（T）、多个酶切位点、有抗性标识、复制子和RBSSD序列。（如图6-13）还应结合考虑：质粒拷贝能力和稳定性，转译蛋白表示形式和存放地点（分泌型/包涵体/融合蛋白），蛋白质分子量、性质和稳定性以及选择适当宿主细胞。基因表达载体的构建专家讲座第25页乳糖开启子（Lac）无乳糖时，调整基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻止转录；有乳糖时，乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功效。如图6-2而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖）诱导转录。Lac开启子改建如图6-3、6-4(a)

(b)基因表达载体的构建专家讲座第26页Trp开启子色氨酸开启子（Trp）阻遏蛋白在有色氨酸时，二者结合，阻遏蛋白变构激活而与开启子结合，阻止RNA聚合酶转录。无色氨酸时，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸竞争性抑制剂，惯用作诱导剂，诱发色氨酸开启子转录。（如图6-5）同时，衰减子对Trp转录也有调整作用（如图6-6）基因表达载体的构建专家讲座第27页Tac开启子Tac开启子是由Trp开启子和Lac开启子构建而成杂合开启子，-35区为Trp开启子次序，-10为LacUV5开启子次序，二者之间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。该开启子只需用IPTG诱导转录即可。如图6-7基因表达载体的构建专家讲座第28页噬菌体PL和PR开启子PL为λφ左向开启区，PR为右向转录开启区，与CI阻遏蛋白结合，可抑制OL或OR转录，但CI在42℃诱导转录（如图6-8）。基因表达载体的构建专家讲座第29页脂蛋白开启子（LPP）脂蛋白为细胞外膜蛋白，细菌中含量高，该开启子表示效率高，由信号肽可将基因表示产物分泌到胞外，惯用来结构分泌型表示载体。基因表达载体的构建专家讲座第30页基因表达载体的构建专家讲座第31页基因表达载体的构建专家讲座第32页基因表达载体的构建专家讲座第33页基因表达载体的构建专家讲座第34页基因表达载体的构建专家讲座第35页基因表达载体的构建专家讲座第36页基因表达载体的构建专家讲座第37页基因表达载体的构