环境工程微生物学实验顾彦

环境工程微生物学实验顾彦环境工程微生物学实验顾彦第1页试验一

微生物细胞计数环境工程微生物学实验顾彦第2页

目标要求1.了解血球计数板结构及计数原理。2、掌握使用血球计数板进行微生物计数方法。

环境工程微生物学实验顾彦第3页试验原理

测定微生物数量方法很多，通常采取有显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。

显微镜直接计数法

将小量待测样品悬浮液置于一个尤其含有确定面积和容积载玻片上，又称血球计数板，于显微镜下直接计数一个简便、快速、直观方法。环境工程微生物学实验顾彦第4页血球计数板结构环境工程微生物学实验顾彦第5页血球计数板计算方法血球计数板上刻有一长宽各为1毫米方形大格，其体积为0.1mm3。计数板有两种刻度，一个是每大格分为16个中格，而每中格又分25个小格，每大格为16×25小格=400小格，而另一个，则是每大格分为25个中格，而每中格又分为16个小格，则每大格为25×16=400小格（计数板上标识为XB·K25）计数时，假如使用16格×25格规格计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）酵母菌数。假如使用25格×16格规格计数室除了取其4个对角方位外，还需再数中央一个中格(即80个小方格)酵母菌数。

(6)当碰到位于大格线上酵母菌，普通只计数大方格上方和左方线上酵母细胞(或只计数下方和右方线上酵母细胞)。环境工程微生物学实验顾彦第6页计数公式(1)16×25血球计数板计算公式：酵母细胞数／ml=（100小格内酵母细胞个数／100）×400×10000×稀释倍数(2)25x16血球计数板计算公式：酵母细胞数／ml=（80小格内酵母细胞个数／80）×400×10000×稀释倍数环境工程微生物学实验顾彦第7页试验器材

显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻片、吸管、吸水纸。环境工程微生物学实验顾彦第8页操作步骤1.镜检计数室对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后才能进行计数。2.加样品在血球计数板上盖上盖玻片,用滴管将摇匀酵母菌液由盖玻片边小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。3.计数将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室位置，再换高倍镜计数。25个中格取计数板四角和中间位置五个中方格计菌数。重复计2-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中菌体个数。4.清洗血球计数板计数后将血球计数板用自来水冲洗洁净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不洁净，则必须重复洗涤洁净为止。环境工程微生物学实验顾彦第9页结果统计

第一个中格第二个中格第三个中格第四个中格第五个中格第一次测定第二次测定第三次测定平均环境工程微生物学实验顾彦第10页思索题1.使用血球计数板应注意什么问题?2.试分析影响本试验结果误差起源并提出改进办法环境工程微生物学实验顾彦第11页试验二

培养基配制和灭菌

环境工程微生物学实验顾彦第12页试验目标1.熟悉玻璃器皿洗涤和灭菌前准备。2.掌握培养基和无菌水制备方法。3.掌握高压蒸气灭菌技术。环境工程微生物学实验顾彦第13页试验原理培养基是用人工方法将各种营养物质按微生物生长代谢需要配制成一个营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且百分比适当水分、碳源、氮源、无机盐、生长原因以及一些特需微量元素外还应含有适宜酸碱度〔pH值〕、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。

环境工程微生物学实验顾彦第14页试验器材(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10％NaOH溶液、l0％盐酸溶液、琼脂、水(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、烘箱。环境工程微生物学实验顾彦第15页试验步骤一、玻璃器皿洗涤和包装清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。棉塞制作包装培养皿和移液管等。

2-1棉塞制作方法2-2移液管灭菌前包装环境工程微生物学实验顾彦第16页二、培养基配制

牛肉膏蛋白胨培养基配制（一）培养基配方：

牛肉膏2.5g蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.2~7.4。（二）操作步骤：

1.取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。2.按配方逐一正确称取各种成份，依次加入水中溶解。注意：a.前一个成份溶解之后，才能加入下一个成份b.蛋白胨、肉膏可加热促进溶解c.加热过程应不停搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失水量。环境工程微生物学实验顾彦第17页

3.调pH值：用10％NaOH调pH至7.2~7.4，用精密pH试纸对照。

4.过滤

液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果观察。不过供普通使用培养基，该步可省略。

5.分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染(见图2－3)。分装量：固体培养基约为试管高度1／5，灭菌后制成斜面（图2－4）。分装入锥形瓶内以不超出其容积3/5为宜。半固体培养基以试管高度1/3为宜．灭菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。

6.包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。

7.灭菌备用：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力0.103MPa）培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。环境工程微生物学实验顾彦第18页

图例

图2－3培养基分装图2－4斜面制作环境工程微生物学实验顾彦第19页三、稀释水制备1.取一个250mL锥形瓶装90(或99)mL蒸馏水，放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。2.另取5支18mm×180mm试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。无菌稀释水为微生物分离试验中所需要材料。环境工程微生物学实验顾彦第20页四、灭菌加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌操作方法a.将待灭菌物品放入恒温箱，将温度调整至160℃并维持2h；b.把恒温箱调整旋钮调回零处，待温度降到50℃左右，才能将物品取出。环境工程微生物学实验顾彦第21页湿热灭菌：高压蒸气灭菌法

高压蒸气灭菌法操作步骤以下：1.灭菌锅内加入一定量水。2.将待灭菌物品放入锅内，并关严锅盖。

注意：器物不能装得太满。3.接通电源，进行加热。4.排除高压锅内冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排出蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。环境工程微生物学实验顾彦第22页5.当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内温度为121℃)即开始灭菌，使其维持15～30min。对热不稳定培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2)，延长时间。6.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩下水。7.待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保留备用。环境工程微生物学实验顾彦第23页间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏培养基灭菌。操作方法：a.待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，天天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，连续3d重复进行。b.在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37℃恒温条件下培养24h，这么能够使每次蒸煮后未杀死残留芽孢萌发成营养体，方便下次蒸煮时杀灭。c.第三次蒸煮之后基础无菌，但为了确保无菌仍要放在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。环境工程微生物学实验顾彦第24页

过滤除菌法：

不能用加热灭菌液体物质（如维生素、血清），普通可用细菌过滤器进行除菌。

用于除菌滤器：a.蔡氏滤器，b.注射器装置滤器环境工程微生物学实验顾彦第25页思索题1.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为何?2.培养基配制完成后，为何必须马上灭菌?若不能及时灭菌应怎样处理？已灭菌培养基进行无菌检验？3.高压蒸汽灭菌中为何要把冷空气排净，为何在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?

环境工程微生物学实验顾彦第26页试验三细菌纯种分离、培养和接种技术环境工程微生物学实验顾彦第27页试验目标1.掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细菌方法，从而取得若干种细菌纯培养技能。2.掌握几个接种技术。环境工程微生物学实验顾彦第28页实验器材

无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2支、10mL1支。营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。环境工程微生物学实验顾彦第29页实验步骤一、细菌纯种分离

环境工程微生物学实验顾彦第30页(一)稀释平板法1.取样用无菌锥形瓶到现场取一定量湖水，快速带回试验室。2.稀释水样将1瓶90mL和5管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在无菌操作条件下，用10mL无菌移液管吸收10mL水样(或其它样品)加入编号为10－1无菌水(内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为10－1浓度菌液。用1mL无菌移液管吸收1mL10－1浓度菌液于编号为10－2无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10－2浓度菌液。一样方法，依次稀释到10－6。环境工程微生物学实验顾彦第31页稀释液制备10mL试样90mL蒸馏水环境工程微生物学实验顾彦第32页3.平板制作①取10套无菌培养皿编号，10－4、10－5、10－6各3个，另一个为空气对照。②取1支1mL无菌移液管从浓度小菌液开始，以10－6、10－5、10－4为序分别吸收0.5mL菌液于对应编号培养皿内(每次吸收前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。环境工程微生物学实验顾彦第33页③加热培养基，当其冷至45℃左右时，右手拿装有培养基锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针往返转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。

a:皿法b:倒平板环境工程微生物学实验顾彦第34页④取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。环境工程微生物学实验顾彦第35页（二）平板划线法1.平板制作：将融化并冷至约50℃肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。2.划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)。划线完成盖好皿盖，30℃培养24～48h后观察结果。环境工程微生物学实验顾彦第36页平板划线分离划线方法

左：连续划线法（1，2依次划线起点）右：分区划线法（1，2，3，4依次划线起点）环境工程微生物学实验顾彦第37页

二、细菌接种技术接种方法：常见有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基穿刺接种法。接种工具：常见有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。环境工程微生物学实验顾彦第38页

（一）斜面接种法①左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种空白斜面(两支试管斜面同时向上)。右手将棉塞旋松，方便在接种时轻易拔出。②右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。③将两支试管上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。123环境工程微生物学实验顾彦第39页④将已灼烧过接种环伸入菌种试管内。先冷却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并快速伸入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最终再次烧红接种环，则接种完成。45678环境工程微生物学实验顾彦第40页

（二）液体接种和穿刺接种1.液体接种法(从斜面菌种接入培养液)：用接种环挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最终将接种环烧红灭菌。2.穿刺接种法(从斜面菌种接入(半)固体培养基)：用接种针经火焰灭菌后，挑取少许菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线迟缓将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完成。环境工程微生物学实验顾彦第41页

（三）稀释平板涂布法1.稀释样品：方法同稀释平板分离法2.倒平板：将融化并冷至50℃左右培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板3.用无菌移液管吸收一定量经适当稀释标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀4.将培养皿正摆在恒温箱中，调整一定温度进行培养。假如培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。环境工程微生物学实验顾彦第42页（四）液体培养基中菌种接入液体培养基接种工具：无菌移液管和无菌滴管移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌用无菌移液管自菌种管中吸收一定量菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。环境工程微生物学实验顾彦第43页思索题1.斜面接种取菌前为何要将灼烧过接种针在无菌培养基上沾一下？2.用一根无菌移液管接种几个浓度水样时，应从哪个浓度开始？为何？环境工程微生物学实验顾彦第44页试验四滤膜法测定总大肠菌群

本方法适合用于生活饮用水和低浊度水源水中总大肠菌群数测定。环境工程微生物学实验顾彦第45页试验目标1.了解总大肠菌群数量指标在环境领域主要性，掌握总大肠菌群检验方法。2.经过检验过程，了解大肠菌群生化特征。环境工程微生物学实验顾彦第46页试验原理用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上经典大肠菌群菌落数，算出每升水样中含有总大肠菌群数。环境工程微生物学实验顾彦第47页试验器材显微镜、锥形瓶、移液管、灭菌培养皿、小试管、试管（18mm×180mm）、吸管、接种环、试管架、过滤器、抽滤设备、无菌镊子、滤膜

（孔径为0.45μm）、培养箱:36±1℃、冰箱:0～4℃、天平。革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、体积分数为95％乙醇、番红染液。环境工程微生物学实验顾彦第48页品红亚硫酸钠培养基（乙）蛋白胨10g酵母浸膏5g牛肉膏5g乳糖10g琼脂20g磷酸氢二钾3.5g无水亚硫酸钠5g左右碱性品红乙醇溶液(50g/L)20mL蒸馏水1000mLpH：7.2~7.4灭菌条件：0.072Mpa（1150C，15~20min）环境工程微生物学实验顾彦第49页乳糖蛋白胨培养基蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L)1mL蒸馏水1000mLpH：7.2~7.4灭菌条件：0.072Mpa（1150C，20min）环境工程微生物学实验顾彦第50页试验步骤一、准备工作1.滤膜灭菌:将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。2.滤器灭菌:用点燃酒精棉球，火焰灭菌。也可用121℃高压灭菌20min。环境工程微生物学实验顾彦第51页二、过滤水样用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘个别，将粗糙面向上，贴放在已灭菌滤床上、，固定好滤器，将333mL水样(如水样含菌数较多，可降低过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在-500Pa压力下抽滤。环境工程微生物学实验顾彦第52页三、培养水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘个别，移放在品红亚硫酸钠培养基平板上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，二者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养22～24h。

环境工程微生物学实验顾彦第53页四、观察结果挑出符合以下特征菌落进行革兰氏染色、镜检。

紫红色，含有金属光泽菌落。

深红色，不带或略带金属光泽菌落

淡红色，中心色较深菌落。凡革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。

环境工程微生物学实验顾彦第54页五、试验结果计算滤膜上生长总大肠菌群数

将自来水中总大肠菌群数量计算出来水中总大肠菌群数(个/L)＝滤膜生长菌落数×1000÷过滤水样量(mL)

（滤膜上菌落数以20～60个/片为适宜）环境工程微生物学实验顾彦第55页思索题1.检验饮用水中大肠菌群有何意义？2.试验过程中有什么问题，你认为原因何在，怎样克服？环境工程微生物学实验顾彦第56页试验五空气中微生物测定环境工程微生物学实验顾彦第57页

了解不一样环境条件下，空气中微生物分布情况；学习并掌握检测和计数空气微生物基础方法。试验目标环境工程微生物学实验顾彦第58页灭菌培养皿、天平、称量纸、恒温箱、培养基试验器材环境工程微生物学实验顾彦第59页(—)肉汤蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂20.0g、自来水1000mL、pH7.2~7.4灭菌条件:0.103Mpa（1210C、15~20min）环境工程微生物学实验顾彦第60页（二）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）可溶性淀粉20gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4·7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4·7H2O0.5g琼脂20g蒸馏水