荧光免疫技术专家讲座

第八章荧光免疫技术第一节概述一、荧光基本知识二、荧光物质荧光免疫技术专家讲座第1页第二节荧光抗体技术一、标本制作二、荧光抗体制备三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜基本结构第三节荧光免疫分析类型一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第2页第四节荧光免疫技术在医学检验中应用一、荧光抗体技术应用二、荧光免疫测定应用思索题小结荧光免疫技术专家讲座第3页

第一节概述

荧光免疫技术专家讲座第4页荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

一、荧光基本知识荧光免疫技术专家讲座第5页发射光谱和激发光谱

发射光谱是指固定激发波长，在不一样波长下统计样品发射荧光强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不一样波长激发光激发样品统计对应荧光发射强度。

荧光基本知识荧光免疫技术专家讲座第6页荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光百分率计算公式:

荧光效率=

荧光基本知识荧光免疫技术专家讲座第7页荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生荧光衰减到一定程度时所用时间。各种荧光物质荧光寿命不一样。

荧光基本知识荧光免疫技术专家讲座第8页荧光淬灭

定义:荧光物质在一些理化原因作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。荧光基本知识荧光免疫技术专家讲座第9页荧光偏振

FH－FLP＝──────FH＋FL荧光基本知识荧光免疫技术专家讲座第10页荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC衬比染色或双标识FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC衬比染色或双标识FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标识FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标识或多标识FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质是一类能吸收激发光光能而发射荧光物质。

惯用荧光物质二、荧光物质荧光免疫技术专家讲座第11页

第二节荧光抗体技术

荧光免疫技术专家讲座第12页荧光抗体技术基本原理

荧光素标识抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察展现特异荧光抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对本身抗体进行定性和滴度测定。荧光免疫技术专家讲座第13页荧光抗体技术内容

荧光抗体制备标本制作荧光抗体染色荧光显微镜检验荧光免疫技术专家讲座第14页抗体要求

高特异性高亲和力经纯化提取IgG

一、荧光抗体制备荧光免疫技术专家讲座第15页有能与蛋白质形成共价健化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合色素及其降解产物易于去除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高荧光效率。荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有生化与免疫性质。标识方法简单、安全无毒。与蛋白质结合物稳定，易于保留。荧光素要求荧光抗体制备荧光免疫技术专家讲座第16页抗体荧光素标识标识原理:利用抗体蛋白自由氨基与FITC异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标识方法:

搅拌法：适于标识体积较大、蛋白含量较高抗体。标识时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。

透析法：适于标识样品量少，蛋白含量低抗体。标识比较匀，非特异染色较低。荧光抗体制备荧光免疫技术专家讲座第17页去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过分抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体纯化荧光抗体制备荧光免疫技术专家讲座第18页荧光素与蛋白结合率：F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释荧光抗体判定荧光抗体制备荧光免疫技术专家讲座第19页-20℃：保留1～2年真空干燥：长久保留荧光抗体保留荧光抗体制备荧光免疫技术专家讲座第20页组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最惯用）印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织

涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞标本类型二、标本制作荧光免疫技术专家讲座第21页冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清楚。

石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织切片类型标本制作荧光免疫技术专家讲座第22页固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃标本固定和保留标本制作荧光免疫技术专家讲座第23页直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标识特异性抗体直接与对应抗原反应。三、荧光抗体染色及结果判断荧光免疫技术专家讲座第24页间接法特异性抗体与对应抗原反应，荧光素标识抗抗体再与第一抗体结合。

间接荧光抗体染色法示意图荧光抗体染色及结果判断荧光免疫技术专家讲座第25页双标识法两种荧光素分别标识两种不一样特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断荧光免疫技术专家讲座第26页

设置试验对照:阳性对照和阴性对照

区分特异和非特异染色

阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断荧光免疫技术专家讲座第27页

“-”：无或仅见极微弱荧光。

“+”：荧光较弱但清楚可见。“++”：荧光明亮。“+++”：刺眼强荧光。特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。依据呈"++"血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断荧光免疫技术专家讲座第28页荧光显微镜

利用一定波长激发光对样品进行激发，产生一定波长荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

四、荧光显微镜基本结构荧光免疫技术专家讲座第29页光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头

荧光显微镜荧光显微镜基本结构荧光免疫技术专家讲座第30页隔热滤光片：阻断红外线经过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长光域，提供适当激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜滤光片荧光显微镜基本结构荧光免疫技术专家讲座第31页透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路荧光显微镜基本结构荧光免疫技术专家讲座第32页

第三节荧光免疫分析类型

荧光免疫技术专家讲座第33页荧光免疫分析基本原理将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。荧光免疫技术专家讲座第34页荧光抗体技术荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相荧光免疫测定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应特异性与荧光技术敏感性相结合，反抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术类型荧光免疫技术专家讲座第35页荧光免疫测定方法类型

非均相荧光免疫测定：

时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定均相荧光免疫测定：

荧光偏振免疫测定荧光免疫技术专家讲座第36页自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光基本原理时间分辨检测原理示意图时间分辨一、时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第37页stokes位移:激发光谱和发射光谱波长差镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重合stokes位移基本原理时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第38页发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高基本原理发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第39页比活性：单位时间每个标识分子被探测信号量荧光激发光源1000次/S激发，比活性提升基本原理荧光标识物相对比活性时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第40页结合β-二酮体Eu3+解离酸性增强液荧光增强Eu3+标识抗原抗体复合物基本原理信号增强时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第41页

镧系元素铕(Eu3+)（最惯用）钐(Sm3+)铽(Tb3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+)标识物荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0常见荧光物质荧光寿命时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第42页标识方法

双功效螯合剂：1-（对-苯偶氮）-EDTA异硫氰酸苯基-EDTA异硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）标识方法：一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第43页方法类型

双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第44页方法类型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标识抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标识抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第45页方法类型固相抗体竞争法待检抗原和Eu3+标识抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第46页方法类型固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量Eu3+标识抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第47页灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级标识物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法评价时间分辨荧光免疫测定荧光免疫技术专家讲座第48页光线经过偏振滤光片后，形成一个方向平面光称为偏振光。偏振荧光(绿光,525nm～550nm)偏振光(蓝光,485nm)荧光物质基本原理二、荧光偏振免疫测定荧光免疫技术专家讲座第49页

抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图基本原理荧光偏振免疫测定荧光免疫技术专家讲座第50页方法评价

样品用量少荧光素标识试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫测定荧光免疫技术专家讲座第51页基本原理荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图

碱性磷酸酶标识抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。三、荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第52页酶和荧光底物荧光酶免疫测定标识用酶及荧光底物

标识酶底物荧光产物激发光(nm)荧光(nm)对应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第53页方法类型

双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第54页方法类型双抗体夹心法固相抗体和酶标识抗体与待检原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第55页方法类型双抗原夹心法固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。

荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第56页方法类型固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第57页方法评价

用酶和荧光底物化学反应作为放大系统，提升灵敏度背景荧光干扰测定，用固相荧光酶免疫测定效果好荧光酶免疫测定荧光免疫技术专家讲座第58页

第四节荧光免疫技术在医学检验中应用

荧光免疫技术专家讲座第59页①本身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)一、荧光抗体技术应用荧光免疫技术专家讲座第60页②病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术应用荧光免疫技术专家讲座第61页③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术应用荧光免疫技术专家讲座第62页④细胞表面抗原和受体检测将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计仪器中经过喷嘴逐一流出，经单色激光照射发出荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。

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