分解纤维素的微生物分离专家讲座

分解纤维素微生物分离YNMZZXzjx分解纤维素的微生物分离专家讲座第1页㈠纤维素与纤维素酶1.纤维素

纤维素是一个由葡萄糖首尾相连而成高分子化合物，是含量最丰富多糖类物质。一、基础知识

植物根、茎、叶等器官都含有大量纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高天然产物。分解纤维素的微生物分离专家讲座第2页土壤中一些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。分解纤维素的微生物分离专家讲座第3页纤维素是地球上含量最丰富多糖类物质，植物每年产生纤维素超出70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶微生物所利用，不会大量积累。在草食性动物等消化道内，也共生有分解纤维素微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素能力。人类可应用分解纤维素微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。分解纤维素的微生物分离专家讲座第4页2.纤维素酶

纤维素酶是一个复合酶，普通认为它最少包含三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素分解纤维素的微生物分离专家讲座第5页①取二支20mL试管试验：纤维素酶分解纤维素试验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min摇床上振荡1h⑥结果：乙试管滤纸条消失

讨论：乙试管滤纸条为何会消失？甲试管作用是什么？分解纤维素的微生物分离专家讲座第6页提醒：本试验自变量是纤维素酶有没有，自变量操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量缓冲液，不能加入蒸馏水，不然会影响溶液pH。试验分析：P27小试验是怎样组成对照？分解纤维素的微生物分离专家讲座第7页刚果红染色法

刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

（二）纤维素分解菌筛选

当我们在含有纤维素培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心透明圈，这么我们就能够经过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。分解纤维素的微生物分离专家讲座第8页分解纤维素的微生物分离专家讲座第9页二、实验设计

请你依据试验流程图和提供三个资料以及“操作提醒”，在思索相关问题基础上，设计出一个详细试验方案。土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布在判别纤维素分解菌培养基上筛选产生透明圈菌落分解纤维素的微生物分离专家讲座第10页①分布环境1、土壤取样：富含纤维素环境中操作步骤生物与环境相互依存关系，在富含纤维素环境中纤维素分解菌含量相对提升，所以从这种土壤中取得目标微生物几率要高于普通环境。②原因分解纤维素的微生物分离专家讲座第11页③实例：树林中多年落叶形成腐殖土，多年积累枯枝败叶等。④讨论:假如找不到适当环境，能够将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存适宜环境。普通应将滤纸埋于深约10cm左右土壤中。分解纤维素的微生物分离专家讲座第12页2、选择培养

增加纤维素分解菌浓度，以确保能够从样品中分离所需要微生物。

①目标：②制备选择培养基：③操作：

将土样加入装有30ml选择培养基锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。分解纤维素的微生物分离专家讲座第13页培养基成份分析培养基组成提供主要营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水分解纤维素的微生物分离专家讲座第14页提醒：自变量为培养基种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。A、旁栏中配方是液体培养基还是固体培养基？为何？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B、这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，是怎样进行选择？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素微生物能够大量繁殖。C、你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用分解纤维素的微生物分离专家讲座第15页

在选择培养条件下，能够使那些能够适应这种营养条件微生物得到快速繁殖，而那些不适应这种营养条件微生物繁殖被抑制，所以能够起到“浓缩”作用。为何选择培养能够“浓缩”所需微生物？分解纤维素的微生物分离专家讲座第16页思索：本试验流程与课题2中试验流程有哪些异同？

本试验流程与课题2流程区分以下。课题2是将土样制成菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题经过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在判别培养基上。其它步骤基本一致。分解纤维素的微生物分离专家讲座第17页按照课题1稀释操作方法，将选择培养后培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释101102103104105106分解纤维素的微生物分离专家讲座第18页4.将样品涂布到判别纤维素分解菌培养基上（1）制备判别培养基:（2）涂布平板：将稀释度为104～106菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。分解纤维素的微生物分离专家讲座第19页培养基组成提供主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素判别纤维素分解菌培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)分解纤维素的微生物分离专家讲座第20页方法一：先

，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在

时就加入刚果红。培养微生物倒平板5.刚果红染色法

挑选产生透明圈菌落，普通即为分解纤维素菌落。分解纤维素的微生物分离专家讲座第21页这两种方法各有哪些优点与不足？染色法优点缺点方法一方法二颜色反应基本上是纤维素分解菌作用1.操作繁琐2.刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便不存在菌落混杂问题1.产生淀粉酶微生物也产生含糊透明圈(假阳性反应)2.有些微生物能降解色素，形成显著透明圈分解纤维素的微生物分离专家讲座第22页方法一中NaCl溶液作用？思索：

漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢刚果红，以免出现透明圈不够清楚。用这方法能够判断酶活力大小。实际上刚果红是结合到培养基多糖底物，但分解纤维素细菌能够产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这么刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就能够使结合不牢刚果红洗去，这么就留下大大小小透明圈，大透明圈当然分解纤维素能就强！分解纤维素的微生物分离专家讲座第23页比较项目分解尿素细菌纤维素分解菌选择培养基原理培养基类型目标鉴定培养基原理现象方法将细菌涂布在只有尿素做氮源选择培养基上将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源选择培养基上固体培养基液体培养基筛选菌株选择培养分解纤维素的微生物分离专家讲座第24页比较项目分解尿素细菌纤维素分解菌选择培养原理培养基类型目标鉴定培养基原理现象方法在细菌分解尿素化学反应中，细菌合成脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红刚果红能够与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心透明圈观察菌落周围是否有着色环带出现来判定尿素分解菌观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法刚果红染色法分解纤维素的微生物分离专家讲座第25页

在产生显著透明圈