免疫组化和特殊染色专家讲座

第一节免疫组织化学技术概述免疫组化和特殊染色专家讲座第1页（一）发展简史

1941年Coons首先用荧光素标识抗体检测肺组织内肺炎双球菌取得成功。60年代Nakane建立酶标抗体技术利用铁蛋白标识Ab技术70、80年代多位科学家改良上述技术，建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶（PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC）法使免疫组织化学进入了应用阶段。免疫组化和特殊染色专家讲座第2页年以后各种免疫组化技术愈加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功效代谢综合研究一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是当前生命科学工作者应该掌握基本技术之一。免疫组化和特殊染色专家讲座第3页

定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合原理，经过化学反应使标识抗体显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。将试剂抗原或试剂抗体用能够微量检测标识物进行标识，在与标本中对应抗体或抗原反应后，能够无须测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中标识物，经过标识物放大作用，深入提升了免疫技术敏感性。（二）免疫组织化学原理免疫组化和特殊染色专家讲座第4页抗原是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）物质。抗原基本特征有两种，一是诱导免疫应答能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答产物发生反应，也就是抗原性

免疫组化和特殊染色专家讲座第5页病原微生物在医疗中将病原微生物制成疫苗进行预防接种，能够提升人免疫力。嗜异性抗原一类与种属特异性无关、存在于人以及一些动物、植物、微生物性质相同抗原。肿瘤抗原由物理、化学原因或一些病毒诱发试验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在一些人类肿瘤中心存在着与病毒亲密相关抗原。同种异体抗原动物免疫血清与人类相关抗原

免疫组化和特殊染色专家讲座第6页抗体（antibody）指机体免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成浆细胞所产生、可与对应抗原发生特异性结合免疫球蛋白。免疫组化和特殊染色专家讲座第7页世界著名抗体企业

Santa企业、Abcam企业、Abgent企业、ProteintechGroup、CellSignalingTechnology（CST）、罗氏企业（Roche）免疫组化和特殊染色专家讲座第8页

它借助于荧光素、酶等标识抗体与组织切片或细胞涂片中相关抗原相结合，因为荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定显色处理，展现醒目标阳性色彩，从而可准确定位欲测定抗原物质。

标识物免疫组化和特殊染色专家讲座第9页荧光素、酶标识抗体抗原荧光阳性色彩显微镜观察组织抗原抗体酶荧光素免疫组化和特殊染色专家讲座第10页免疫组化和特殊染色专家讲座第11页

三大系统本技术是应用免疫学原理来识别待测抗原，再经过酶和底物作用外加显色剂，将上述反应显示出来。

免疫组化和特殊染色专家讲座第12页免疫组织化学识别系统联结系统显示系统免疫组化和特殊染色专家讲座第13页识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中靶抗原。抗原抗体特异性结合是本技术基本依据。免疫组化和特殊染色专家讲座第14页联结系统由联结抗体组成。它作用是联接识别系统和显示系统。免疫组化和特殊染色专家讲座第15页显示系统目标是使抗原抗体间特异性结合变为肉眼可见。所以显示系统由标识酶，底物和显色剂组成，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。免疫组化和特殊染色专家讲座第16页特点：特异性强灵敏度高定位准确和简便快速等优点又能够将形态、功效及代谢研究有机结合起来。免疫组化和特殊染色专家讲座第17页IHC方法1过去用过方法——ABC法，SP法。——三步法，使用生物素2目前最惯用方法——二步法：EnliVision显色系统（即用型非生物素免疫组化EnliVisionTMplus检测试剂盒）将多个抗鼠和抗兔IgG分子二抗与辣根过氧化物酶经过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50倍。敏感、省时、方便、背景低（防止了内源性生物素干扰）。免疫组化和特殊染色专家讲座第18页3

最新一代免疫组化NovolinkPolymer法：使用小分子聚合物（降低细胞薄膜硬脂妨碍，比传统中大分子聚合物染色更显著），信号放大更强，还能够检测到组织中低浓度抗原。

IHC方法免疫组化和特殊染色专家讲座第19页

EnliVision法工作程序：切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理玻片：多聚赖氨酸，APES）H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗组织切片预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出抗原决定簇），TBS漂洗内源性过氧化物酶阻断一抗孵育，TBS漂洗二抗孵育，TBS漂洗DAB显色，蒸馏水中止反应苏木素复染及封片

IHC技术基本操作流程免疫组化和特殊染色专家讲座第20页切片烤片脱蜡水化H2O2处理热修复一抗二抗

Enlivision试剂DAB显色苏木素复染免疫组化和特殊染色专家讲座第21页IHC染色结果判读标准免疫组化和特殊染色专家讲座第22页玻片干燥造成“边缘效应”假阳性未阻止内源性过氧化物酶阻止内源性过氧化物酶后I.注意影响IHC结果判读原因免疫组化和特殊染色专家讲座第23页酒精固定福尔马林固定胰腺，insulin平滑肌肉瘤，SMA气泡影响抗体抗体反应冰冻切片石蜡切片结肠，CEA假阴性：注意内对照免疫组化和特殊染色专家讲座第24页假阴性蛋白酶处理后蛋白酶未处理皮肤，IV胶原甲状旁腺，PTH微波未处理微波处理后免疫组化和特殊染色专家讲座第25页II.染色特异性判定免疫组化和特殊染色专家讲座第26页免疫组化和特殊染色专家讲座第27页免疫组化和特殊染色专家讲座第28页免疫组化和特殊染色专家讲座第29页FujitaHealthUniversitySchoolofMedicineMitochondoriaApicalmembraneBasolateralmembranePlasmaMembrane+PER・GolgiPlasmamembranePER+GolgiGolgiapparatusEndocrinegranuleEndocrinegranuleLysosomeCytosolNucleusCytoskeleton

amylaselysozomePAcP

S-100NSEprefixationdiffusionartifact

CEAEMAALPCD10

cytochromeP-450

immunogloblinAFPHCGfactorⅧ-RAprolactininactivatedpituicyte

SCEGFRE-cad

Leu4HLA-DRCEA,EMA,SC,CA19-9incancercell

Leu1LCAPALPinseminomacellCerb-B2

SC,AFPEMA,immunoglobulininspecialconditions

chromograninAserotoninPeptidehormone

DNApolymeraseS-100(occasional)estrogenreceptor

keratinincarcinoid,mesotheliomavimentin

keratininadenocarcinomahepatocyteactin

keratinvimentinGFAPtubulin

各

抗

原

在

细

胞

内

显

色

方

式免疫组化和特殊染色专家讲座第30页细胞膜阳性细胞粘附分子：E-cadherin、CD31、CD56等交联膜蛋白分子：catenin、dystrophin等细胞表面受体：EGFR、c-erbB2、c-kit/CD117（酪氨酸激酶受体）等绝大多数白细胞抗原:LCA、CD20、CD2、CD5等表面或跨膜蛋白：Villin、BerEP4、EMA、CEA、CA125、EBV-LMP1等免疫组化和特殊染色专家讲座第31页细胞核阳性细胞周期素蛋白：cyclins、cyclin依赖激酶(cdk)、cdk抑制剂(如

p16)等细胞增殖相关蛋白：Ki67、PCNA转录因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、PAX5肿瘤抑制基因：如

p53、p63、Rb、WT1基因错配产物：如MLH1、MSH2免疫组化和特殊染色专家讲座第32页细胞核酶：如TdT类固醇激素受体：如ER、PR、AR细胞核钙结合蛋白：如S100蛋白、calretinin定位细胞核病毒：如CMV、HBcAg（核+核周）NeuN：neuronalnuclei，表示于成熟神经元免疫组化和特殊染色专家讲座第33页细胞浆内颗粒状阳性--定位于细胞器溶酶体颗粒：如lysozyme、CD68、myeloperoxidase黑色素小体和前黑色素小体：如HMB45、Melan-A细胞毒颗粒：如TIA-1、granzymeB线粒体:如抗线粒体抗体,HEP-PAR1神经内分泌颗粒：各种激素（如PTH、ACTH、insulin）、CgA、SynW-P小体:F-VIII相关抗原分泌颗粒：如BRST-2、surfactant、PSA细胞内微生物：如弓形虫免疫组化和特殊染色专家讲座第34页细胞浆纤维状阳性--中间丝或微丝中间丝;CK;Vimentin;DesminGFAP（glialfibrillaryacidicprotein，胶质纤维酸性蛋白

）NF（Neurofilament，神经元胞浆——节细胞神经瘤，副节瘤/嗜铬细胞瘤，神经母细胞瘤）Nestin：巢蛋白，神经前体细胞免疫组化和特殊染色专家讲座第35页弥漫或片状细胞浆阳性蛋白分布在细胞内液、大量微囊及内质网中如:myoglobin、hemoglobin、albumin、AFP、NSE、cytoplasmicIg、CD3病毒颗粒/蛋白如:HBsAg（常在核旁着色）从细胞间液吸收蛋白如:

Ig、

albumin免疫组化和特殊染色专家讲座第36页①分化差恶性肿瘤诊疗和判别诊疗；

②证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤；③应用肿瘤胚胎性抗原诊疗一些肿瘤，如癌胚抗原（CEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFP）对肝癌和卵巢内胚窦癌诊疗有帮助；

（三）免疫组化应用免疫组化和特殊染色专家讲座第37页④有时可帮助确定肿瘤良恶性，如应用免疫球蛋白轻链κ和λ来判别滤泡性恶性淋巴瘤和滤泡性反应性增生；⑤研究一些癌症与病毒关系，如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等关系；免疫组化和特殊染色专家讲座第38页⑥为肿瘤治疗选择提供依据，如乳腺癌检测雌、孕激素受体（ER、PR）呈阳性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗可预期取得很好疗效；⑦检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用来预计肿瘤预后。免疫组化和特殊染色专家讲座第39页免疫组化在临床诊疗中应用病例示范（Case1）临床病史资料：48岁，男性，胃活检标本取自胃大弯部位。H&E染色切片描述肿瘤细胞显示在间质中呈癌巢样，邻近腺体肠上皮化生，间质中不规则巢状结构待诊疗.免疫组化和特殊染色专家讲座第40页H&E染色免疫组化和特殊染色专家讲座第41页

首先选择Cytokeratin单克隆广谱角蛋白抗体在细胞巢中呈强阳性染色，证实是上皮起源性肿瘤，在图片顶部是非肿瘤性腺上皮阳性，肿瘤性腺体在底部。免疫组化和特殊染色专家讲座第42页

肿瘤细胞再深入进行cytokeratin7/cytokeratin20染色，染色证实在肿瘤细胞中同时缺乏cytokeratin7/cytokeratin20表示。在这张图片中肠上皮细胞cytokeratin20阳性与邻近肿瘤细胞阴性形成显著对照。cytokeratin7and20在临床中使用中，假如同时都不表示，特异性地表示肿瘤细胞为起源于一些上皮肿瘤（subsetofepithelialtumors），包含肾细胞癌，前列腺癌、肝细胞癌和神经内分泌肿瘤等。免疫组化和特殊染色专家讲座第43页

Synaptophysin测定Synaptophysin全部肿瘤细胞中都显示出较强阳性表示，而在肿瘤细胞中包绕肠腺体呈阴性诊疗:神经内分泌癌免疫组化和特殊染色专家讲座第44页

Ki-67测定:Ki-67在肿瘤细胞展现非常低表示，Ki-67染色一样证实为肿瘤细胞增殖率低，肠腺上皮中Ki-67高表示，可能是胃小凹腺体，与高细胞增殖率腺上皮相比Ki-67在肿瘤细胞中缺乏胞核表示。这些Ki-67标识阴性肿瘤细胞是低分级神经内分泌癌细胞，免疫组化和特殊染色专家讲座第45页第二节免疫组织化学染色前基本技术(一)样品取材

组织标本包含石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。细胞标本后者包含组织印片和细胞涂片。免疫组化和特殊染色专家讲座第46页其中石蜡切片是制作组织标本最惯用、最基本方法，对于组织形态保留好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长久存档，供回顾性研究.免疫组化和特殊染色专家讲座第47页样品制备第一步就是取材，取材好坏关系到试验结果。所以必须做好准备工作。现将组织取材标准和详细要求分述以下：

1刀剪锐利、洁净。

2快速、准确、尽可能保持生活状态，力争1分钟之内放入固定液，最迟不能超过3分钟。

免疫组化和特殊染色专家讲座第48页3一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进行，防止拉锯、牵拉或挤压等动作。

4低温操作，预防自溶现象，通常以

0℃-4℃低温条件下操作为佳。

免疫组化和特殊染色专家讲座第49页5、样品大小适当，光镜样品普通在1.0cm以内，

免疫组织化学样品大约在：2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。电镜样品规格要求切成0.5-1.0cm共3小块。对病理组织取材还应做到以下几点：

①取材部位必须是主要病变区；②必须取病灶与正常组织交界区；③必要时取远离病灶正常组织做对照。免疫组化和特殊染色专家讲座第50页细胞标本取材印片法:惯用于活检标本沉淀法:主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：惯用于淋巴结、软组织、肾、肝、肺等组织。免疫组化和特殊染色专家讲座第51页注意事项：①细胞经离心后细胞粘附性较差，标识过程中轻易脱片，载玻片应涂粘附剂②细胞总数应以105个为宜，并集中在直径0.6-1.0cm圆圈内。③富于粘液标本，未经处理不宜作免疫组化标识。免疫组化和特殊染色专家讲座第52页（二）、组织固定

2、免疫组化标本固定时，好固定剂应

满足哪些要求？

1、目标:固有形态和结构、抗原完整性免疫组化和特殊染色专家讲座第53页①能快速固定抗原；

②预防抗原物质扩散；

③固定后抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应。

免疫组化和特殊染色专家讲座第54页①甲醛固定液：分类较多，最惯用4%多聚甲醛固定液，对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；主要特点：组织穿透性好，收缩性小但对于不一样组织和抗原，可选取不一样固定液。有时候商品化抗体会有比较适合而推荐固定液，请于购置前注意说明书。3、各种固定液：免疫组化和特殊染色专家讲座第55页②Bouin,S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织穿透力较强，固定很好，结构完整，但因偏酸，反抗原有一定损害，且组织收缩显著，不适于组织标本长久保留。③PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原抗原性保留很好。免疫组化和特殊染色专家讲座第56页（三）、组织脱水浸蜡及包埋①脱水透明等过程需在4℃或室温下进行，防止组织抗原损失；②为使组织充分脱水、透明和浸蜡，组织块厚度以1.0-1.5mm为宜;③浸蜡及包埋过程中,石蜡温度应保持在60℃或60℃以下,用熔点低石蜡包埋;④制备蜡块在较低温度进行,故试剂处理时应适当延长,不然会给切片带来困难免疫组化和特殊染色专家讲座第57页惯用包埋法①石蜡包埋②冰冻干燥包埋③塑料包埋免疫组化和特殊染色专家讲座第58页（四）组织切片中载玻片处理

抗原修复过程中，因为高温、高压、辐射等很多原因影响，极易造成脱片。为确保试验正常进行，可选取Poly-L-Lysine、ZLI-9001APESZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005等几个试剂，对已常规清洗载玻片进行处理。详细方法以下：

免疫组化和特殊染色专家讲座第59页Poly-L-Lysine：将洗净、干燥载玻片放入以1:10百分比去离子水稀释多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用器具均为非玻璃制品。免疫组化和特殊染色专家讲座第60页（五）抗原修复

抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖抗原决定簇或变性抗原重新暴露或抗原性得到一定程度恢复过程。免疫组化和特殊染色专家讲座第61页石蜡切片为何要做抗原修复？有那些方法

？

石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽.所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成交联破坏，而恢复抗原原有空间形态。

免疫组化和特殊染色专家讲座第62页

惯用抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，惯用修复液是pH6.00.01mol/L柠檬酸盐缓冲液。免疫组化和特殊染色专家讲座第63页抗原修复方法一、热修复1、微波炉加热法将玻片分别插入抗原修复盒中，以确保各部位玻片受热均匀。在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有小孔盖子。将塑料盒置于微波炉中央，加热2x5min。两次加热之间，加入50ml蒸馏水。加热过程中，组织标本不可干燥。免疫组化和特殊染色专家讲座第64页第二次处理后，将微波炉中修复盒移至室温冷却15-20分钟。不要打开盖子！蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶并置于蒸馏水中。用TBS或PBS液冲洗。进行免疫组化染色。免疫组化和特殊染色专家讲座第65页

在压力锅中放入1500-3000ml抗原修复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入切片架并放入沸腾修复缓冲液中。后加阀，使之加压2分钟。后将压力锅置于流水槽或继续冷却20分钟（减压）。取出切片，蒸馏水冲洗，移至TBS或PBS液中，以防止组织干燥。以下同微波炉修复法。

2、压力锅法免疫组化和特殊染色专家讲座第66页

抗原修复方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。所以应该依据不一样抗原特点，采取不一样修复方法。对一些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。二、酶消化方法免疫组化和特殊染色专家讲座第67页1、胰蛋白酶处理：A滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。B室温37℃孵育20-40分钟，孵育时间长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况而定。C蒸馏水冲洗，终止反应。D阻断内源性过氧化物酶。E免疫组化染色。免疫组化和特殊染色专家讲座第68页2、胃蛋白酶处理A滴加胃蛋白酶工作液于组织上。B最正确消化时间取决于福尔马林固定时间，37℃预热。普通消化10分钟，长至30分钟。C以下同胰蛋白酶处理方法3,4,5。注：过分消化将造成组织结构丢失，并引发组织脱片免疫组化和特殊染色专家讲座第69页三、综合方法微波炉加胰酶修复法：将组织切片置于盛有50ml修复液塑料盒中，封口膜封口后加热5分钟。冷却后打开，将切片置于37℃预热蒸馏水中，胰蛋白酶消化。室温胰蛋白酶处理30秒钟。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。免疫组化染色。免疫组化和特殊染色专家讲座第70页操作中还应注意以下问题：

1、热处理后应注意自然冷却。

2、热处理时要预防切片干燥。

3、应依据不一样抗体选择适当抗原修复方法。

4、一批抗原检测其温度和时间一定保持一致。

免疫组化和特殊染色专家讲座第71页5、注意形态学结构改变(普通经高温修复后胞浆会无显著破坏，