大肠杆菌聚合酶的作用与应用_第1页
大肠杆菌聚合酶的作用与应用_第2页
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文档简介

关于大肠杆菌聚合酶的作用与应用大肠杆菌DNA聚合酶I的活性5’-3’DNA聚合酶活性15’-3’外切核酸酶活性23’-5’外切核酸酶活性3第2页,共13页，2024年2月25日，星期天5’-3’DNA聚合酶活性在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ使DNA链沿5‘→3‘方向延伸。3'Mg2+,dNTP5'

5'3'

DNA聚合酶I第3页,共13页，2024年2月25日，星期天5’-3’外切核酸酶活性从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。3'Mg2+5'

5'3'

DNA聚合酶I第4页,共13页，2024年2月25日，星期天3’-5’外切核酸酶活性由3’端水解DNA链，反应底物是带3'-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3'-OH端降解ds-DNA，可被5'3'聚合活性封闭，也可被带5'磷酸的dNMP抑制5'Mg2+

Mg2+,dNTP3'3'5'DNA聚合酶IDNA聚合酶I第5页,共13页，2024年2月25日，星期天活性能发生的反应切口平移置换反应活性第6页,共13页，2024年2月25日，星期天置换反应如果只有一种dNTP存在，3'5'外切核酸活性将从3'-OH端降解DNA，而5'3'聚合酶活性又在合成DNA，然后在该位置发生一系列的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。

3'5'外切酶活性5'3'

5'3'聚合酶活性第7页,共13页，2024年2月25日，星期天切口平移首先在镁离子存在下用少量DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口。在切口处利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’-3’外切核酸酶活性是切口沿5’-3’方向移动，同时5’-3’DNA聚合酶活性又不断合成DNA。

5'

Mg2+DNaseI

3'

5'

dNTP大肠杆菌DNA聚合酶I

3'

第8页,共13页，2024年2月25日，星期天应用13’-端的末端标记2切口平移法标记DNA3合成cDNA的第二链第9页,共13页，2024年2月25日，星期天3’-端的末端标记先用此酶的3’→5’核酸外切酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；在以其5’→3’聚合酶活性使其使其补平，在高浓度dNTP的条件下，3’-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端的带标记的DNA。第10页,共13页，2024年2月25日，星期天切口平移法标记DNA

在Dnase的作用的基础上产生连内切口，应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。若用聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α-32P，就能使生成的双链带有标记物。根据此原理可做DNA杂交探针。第11页,共13页，2024年2月25日，星期天合成cDNA的第二链

单链cDNA3’-端可形成发卡结构，便于DNA聚合酶I发挥

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