生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座

第五章

动植物细胞培养动力学

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第1页5．1动植物细胞培养特征动植物细胞培养技术是一项将动植物组织、器官或细胞在适当培养基中进行离体培养技术。组织是指由结构和功效相同细胞和细胞间质组成，含有一定形态和生理功效聚集体。器官是指机体中含有特殊结构和完成特殊功效分化部分。组织与器官培养是指在人工条件下，使它们得以继续生存或发展一个培养方法。依据培养对象不一样，细胞培养分为动物细胞培养与植物细胞培养两类，下面介绍这两类细胞培养基本特征。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第2页5．1．1动物细胞培养特征因为动物细胞体外培养含有显著表示产物优点，为传统微生物发酵所无法取代，所以，生物技术中许多有价值生物制品，需要借助于动物细胞培养而获得，这种需求极大地促进了动物细胞培养技术发展。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第3页早在19，美国Harrison在世界上首次将蛙神经组织在试管内培养成功，建立起动物组织体外培养第一块基石。1950年前后，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒汇报，开拓了以动物病毒为研究对象新领域。当初人们已知道在细胞培养物中存在一些有特殊功效蛋白质，如干扰素、抗生素、疫苗等，不过因为动物细胞营养要求复杂，培养要求严格，长久以来未能利用细胞培养来进行有经济价值物质生产。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第4页作为大规模细胞培养，Copsik等成功地进行了相关仓鼠肾细胞(BHK)悬浮培养。随即，细胞培养原理与方法日臻完善。采取在培养液中添加人工合成小球状惰性聚合体载体，大幅度提升了细胞产量，并在10000L发酵罐内成功地进行深层培养。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第5页伴随基因工程技术发展，人们逐步认识到有许多基因产物不能在原核细胞内表示，它们需要经过真核细胞所特有翻译后修饰，以及正确切割、折叠后，才能形成与自然分子一样功效和抗原性，使得动物细胞一跃成为一个主要宿主细胞，用以生成各种生物制品，如病毒疫苗、淋巴因子(如r干扰素等)、单克隆体、红细胞生成素、纤维蛋白溶酶原激活剂、第八因子、肿瘤坏死因子、上皮生长因子和过氧化物歧化酶等。采取大规模细胞培养技术生产珍贵药品在临床诊疗、治疗和预防等方面都有主要意义。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第6页动物细胞培养与微生物培养对比有许多不一样点(表5—1)。主要是动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；生长速度迟缓，易受微生物污染，培养时需要抗生素，且大多数哺乳动物细胞需附着在固体或半固体表面才能生长；对营养要求严格；大规模培养时，不可简单地套用微生物培养经验等。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第7页生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第8页大规模细胞培养主要危险之一是微生物污染。设备、培养基、悬浮系统和操作方法等复杂性都易引发微生物污染，这是细胞培养都存在一个普遍问题，在大规模培养中更为严重。动物细胞生长十分迟缓，并易被大多数微生物污染物所破坏。支原体(mycoplasma)对动物细胞培养威胁最大，因为其感染力强且不易检出。所以，大规模细胞培养成功必要条件是要有一个设备精良细胞库(cellbank)。在细胞库中冷冻细胞不受污染。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第9页因为动物细胞无细胞壁，所以人们普通认为细胞脆性是造成培养控制(如溶氧)复杂化关键。然而，选择坚韧细胞，就不存在上述问题。经仔细设计培养装置可使细胞悬浮液很好混合，在向培养基内流加基质和输送气体时也不会损坏细胞。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第10页动物细胞培养基配方十分复杂，而且还需补充血清和蛋白胨。原料质量控制和培养基生产是大规模细胞培养主要问题。因为血清起源困难，质量不稳定，残留血清给产物提纯带来困难等，所以，常采取无血清培养基。不过，在无血清培养基中更可能出现细胞毒(与水中微量元素或有机污染相关)。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第11页所以，与培养物相接触水必须采取高纯度水。高纯度水腐蚀性很强，而且有从金属物沥出元素能力，所以，凡是与纯水接触不锈钢容器和管道表面都必须进行适当处理。培养基普通需经膜过滤器过滤。惯用膜过滤器可确保其无菌状态，甚至支原体也可被0．1um过滤膜滤出。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第12页当前，利用动物细胞培养方法生产有用产品大致可分为4大类：①疫苗；②干扰素；③单克隆抗体；④遗传重组产品。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第13页总之，动物细胞培养过程特征是：(1)生长速率慢，易被微生物污染，但可采取在培养基中加入抗生素等办法来处理。(2)细胞个体大且无壁，对环境敏感，所以应慎重处理供氧(搅拌与通风)与细胞脆弱矛盾。(3)设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程经验。(4)反应过程成本高，主要用于高附加值产物生产。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第14页生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第15页5．1.2植物细胞培养特征

相关植物细胞培养基础研究很多，而工业规模应用却较少。早在19，出生于奥地利德国植物学家巳Haberlandt就预言植物细胞培养可能性。1937年前后，法国和美国科学家分别成功地进行了胡萝卜和烟草组织培养。随即，人们认识到生长素等植物激素在组织培养中作用。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第16页1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替栽培植株来生产生化制品。近40年来，植物细胞培养研究成功例子已经有不少，如用紫草悬浮培养物生产紫草宁，烟草细胞大量培养等。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第17页与微生物相比，植物细胞含有这么一些特征(表4—1)：①细胞个大，而且细胞壁是以纤维素为主要成份，耐拉不耐扭，所以，抗剪切能力低。②与动物细胞培养类同，生长速率慢，为预防培养过程中染菌，需加抗生素。③细胞培养需氧，而培养液黏度大，且不能强力通风搅拌。④产物在细胞内且产量低。⑤培养植物细胞常生长成各种大小团块(从几个细胞到几百个细胞)，增加了悬浮培养难度等。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第18页生长迟缓等是植物细胞先天不足，然而它能产生一些微生物所不能合成特有代谢产物，如朝鲜参皂角苷、桉树油和一些生物碱等。植物细胞培养技术为大规模生产这些有用物质提供了新路径。细胞培养用于试管苗生产，如兰花等名贵花卉培育，能够不受环境影响。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第19页利用植物细胞培养技术进行工业化生产，有产品规格好；易到达供需平衡；生产占地少等优点。进入20世纪90年代以来，伴伴随紫杉醇研究成功并应用于临床，植物细胞培养及其次级代谢产物研究进入了新发展时期，尤其是诱导子、前体饲喂、两相法培养、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组织培养等新技术和新方法发觉和发展，更显示了植物细胞培养工程在制药领域辽阔发展前景。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第20页另外，将固定化技术应用于植物细胞培养中研究对有效改进植物细胞培养中出现不足有一定成效。能够认为，固定化技术有可能在植物细胞培养中得以应用。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第21页5．2生长模型与培养条件

5．2．1动植物细胞生长模型微生物生长是各种环境因子与细胞内复杂代谢反应综合结果，生长与环境因子关系当前还难以用简单方程式来表示。同理，动植物细胞生长是细胞与影响细胞生长环境因子相互作用综合结果，而且其研究还处于萌芽阶段。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第22页5．2．1．1碳源与生长模型

微生物反应中，细胞生长速率与限制性基质间关系惯用Monod方程来描述。同理，Monod方程也能够用于表示一些碳源与动植物细胞生长速率间关系。比如，在植物细胞培养过程中，多以蔗糖为碳源，据安田报道，烟草细胞在分批培养中，细胞生长速率与蔗糖浓度关系可利用Monod方程来表示，此时umax＝0．023h-1，Ks＝2．35g/L。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第23页蔗糖为碳源时，植物细胞首先分解蔗糖为葡萄糖和果糖，然后优先利用葡萄糖。分别以果糖或葡萄糖为碳源分批培养烟草细胞时，前者有umax＝0．038h-1，Ks=0．25g／L，后者为umax=0．038h-1，Ks＝0．94g／L。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第24页5．2．1．2呼吸与生长模型

因为动植物细胞培养过程是好氧过程，所以，许多科技工作者研究了与细胞呼吸速率相关原因。比如，人参细胞培养中，添加椰子汁后细胞生长速率加紧，耗氧量比不添加椰子汁时显著增大。另外，也有报道，Acer．PsedoplatanusL．细胞培养中，细胞体内含氮量与耗氧量有正比关系。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第25页普通好氧微生物比生长速率u与菌体维持常数m及氧比消耗速率Qo2有以下关系：生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第26页据加藤等所取得烟草细胞分批培养结果表明，当氧为细胞生长限制性原因时,u与Q02有与(5—1)式相同关系。这说明，植物细胞培养中氧消耗，部分用于维持代谢，部分用于生长繁殖，所取得m＝0．09mmol／(g·h)，Y＝0．061g／mmol，与普通微生物m和Y值相比，m很小而Y较大。这可能是植物细胞培养过程中主要特征。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第27页5．2．1．3胞内物质与生长模型

微生物培养中，把细胞内RNA含量作为描述其生长速率指标，且随微生物比生长速率增加，RNA含量增大。植物细胞培养中，也有类似报道。吉田等在进行人参细胞培养中发觉，在对数生长久，细胞RNA含量显著增大。培养烟草细胞时，人们详细研究了细胞比生长速率与细胞内RNA关系，发觉其与普通微生物相同，能够用一次方程表示，即生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第28页总而言之，动植物细胞生长动力学研究，在很大程度上是借鉴了微生物反应动力学理论。从已经有实例看，又多属于定性探讨。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第29页5．2．2动植物细胞培养操作

5．2．2．1植物细胞培养操作植物细胞培养方式依据植物细胞所处状态不一样，分为悬浮培养法与固定化植物细胞培养法，依据操作方式不一样，又分为分批式、重复分批式和连续式培养3种。下面以悬浮培养法(分批、重复分批和连续培养)为例进行介绍。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第30页(1)分批培养植物细胞分批培养与微生物分批培养类同。因为操作简单，从试验室到大型罐广泛应用。分批培养中，植物细胞生长曲线普通呈s形，可显著观察出诱导期、对数生长久、减速期、静止期和衰亡期(死亡期)，不过与细菌和酵母菌培养相比，即使是生长速率快烟草细胞，分批培养时间(一个周期)也要6d以上，这也就是前面所说植物细胞培养先天不足——生长迟缓。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第31页表5—2表示一些植物细胞分批培养中对数生长久u与微生物比较。即使已知生长较快烟草细胞平均世代时间也要15．8h(u＝0.044h-1)，不到酵母比生

长速率l／10。所以，有必要开发长久无菌培养技术。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第32页生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第33页当前，不论在试验室还是在工厂中，大至20t罐，广泛采取分批式操作。藤田开发二步培养法是分批培养法一个变形，同时使用两个反应器，第一个反应器主要是为大量培养细胞，第二个反应器是为增加目标产物含量。分批培养中，在一定范围内增加底物浓度，可增加目标产物产量，但浓度过高又会造成接种细胞死亡。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第34页(2)重复式分批培养若反应器内培养液体积为V，补加量为F'(等于取出量)，则比值F'／V称为替换率D'。D'与连续培养中稀释率D不一样，其与培养液取出至加入完成期间比生长速率u'有以下关系：生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第35页生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第36页(3)连续培养因为连续培养能够确保细胞生长环境长时间稳定，所以，在研究细胞生理或代谢等方面时，连续培养是一个主要培养方法。与微生物连续培养相同，对于单罐连续培养系统，与细胞生长相关物料衡算式为：生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第37页生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第38页生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第39页普通连续培养细胞产率高于分批培养，但因为植物细胞生长速率慢，维持长时间无菌状态是需要处理基本技术问题。另外，单罐连续培养法并不能适应各种反应，所以，有必要开发一些新方法。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第40页5．2．2．2动物细胞培养方法

动物细胞培养方法有两种类型，一类是非贴壁依赖性细胞培养，起源于血液、淋巴组织细胞，许多肿瘤细胞(包含杂交瘤细胞)和一些转化细胞属于这一类型，其可采取类似微生物培养方法进行悬浮培养。另一类是贴壁依赖性细胞培养，大多数动物细胞，包含非淋巴组织细胞和许多异倍体体系细胞属于这一类型，它们需要附着于适量正电荷固体或半固体表面生长。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第41页能够进行悬浮培养动物细胞是一类能无限繁殖细胞，这么细胞又称为确立细胞株。因为动物细胞对剪切力敏感，丰富培养基轻易形成过多泡沫，这都增加了反应器操作难度。悬浮培养多采取分批式操作方法，其原理与植物细胞类同。另外，适合用于动物细胞还有一个连续式操作方法——灌流培养法。这种方法是把细胞置于某种封闭系统中，连续注入新鲜培养基同时，连续等量排出用过培养基，但不排出悬浮细胞。

生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第42页采取这种方法后，从产物开始分泌时起，便可用快速纯化方法不停地从流出培养基中搜集目标产物。即使灌流培养系统含有以上优点，但也存在培养基消耗量比普通悬浮培养高几倍，工作过程复杂，培养物易受污染和培养细胞不稳定等缺点。生化反应器动植物细胞培养动力学专家讲座第43页灌流培养系统可分为3类：