免疫分析法专题知识专家讲座

一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用主要内容免疫分析法专题知识专家讲座第1页一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用主要内容免疫分析法专题知识专家讲座第2页免疫学是研究免疫系统结构与功效，了解其在免疫应答反应中对机体有益防卫功效和有害病理损伤机制，研究有效免疫办法，实现以防病，治病为目标一门当代医学学科。一、概述免疫分析法专题知识专家讲座第3页什么叫免疫分析？基于抗原和抗体特异性反应进行检测一个技术伎俩。抗原抗体反应是指抗原与对应抗体之间发生特异性结合反应。它既能够发生在体内，也能够发生在体外。在体内发生抗原抗体反应为体液免疫应答效应作用。体外抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体检测，用于免疫学诊疗。免疫分析法专题知识专家讲座第4页(1)在试验药品动力学和临床药品学中，测定生物利用度和药品代谢动力学参数等生物药剂学中主要数据，方便了解药品在体内吸收、分解、代谢和排泄情况；(2)在药品临床检测中，对治疗指数小、超出安全剂量易发生严重不良反应或最正确治疗浓度和毒性反应浓度有交叉药品血液浓度进行监测；(3)在药品生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分含量，以实现对生产过程在线监测；(4)对药品中是否存在特定微量有害杂质进行评价。在药品分析中，免疫分析法应用主要集中在以下几方面：免疫分析法专题知识专家讲座第5页免疫分析：

利用抗原与抗体特异性结合作用，来选择性识别和测定，能够作为抗体或抗原待测物.免疫分析方法非标识免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生改变）标识免疫分析标识物有没有非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）酶联免疫分析荧光免疫分析电化学免疫分析化学发光免疫分析免疫分析免疫分析法专题知识专家讲座第6页免疫分析检测发展放射免疫检测（兴起于20世纪70年代)酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；以化学发光为代表光生物学标识及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长久）三个阶段。免疫分析法专题知识专家讲座第7页特点可逆性百分比性反应阶段性特异性免疫分析法特点免疫分析法专题知识专家讲座第8页特异性特异性：抗原与抗体结合反应专一性分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型互补性免疫分析法专题知识专家讲座第9页可逆性可逆性：抗原与对应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后抗原或抗体均能保持原有结构和活性。影响原因：

抗体对对应抗原亲协力－－亲协力越高，结合越牢靠，越不易解离环境原因对复合物影响－pH、离子强度免疫分析法专题知识专家讲座第10页百分比性和反应阶段性百分比性：抗原与抗体发生可见反应需遵照一定量比关系前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalencezone)：抗原抗体百分比适当

免疫分析法专题知识专家讲座第11页一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用主要内容免疫分析法专题知识专家讲座第12页2.1定义抗原（antigen）：指在机体中引发特异性免疫应答反应物质。免疫原性（immunogenicity）：被注射入动物体内后，使其产生循环抗体或改变免疫细胞反应性抗原特异性（antigenicspecificity）：含有能与特异抗体作用性质全抗原（completeantigen）半抗原（hapten）：只能与特异抗体作用，但不引发机体免疫应答分子免疫分析法专题知识专家讲座第13页2.2药品分子抗原性1、药品分子免疫原性大多数药品分子通常都是半抗原；一些蛋白类药品、多肽类药品、激素类药品也是完全抗原。2、药品分子抗原特异性药品分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性可能会发生改变。免疫分析法专题知识专家讲座第14页3、药品分析中，为了得到高效价抗血清，通常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。惯用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白（KLH）等。免疫分析法专题知识专家讲座第15页（1）半抗原和载体结合化学反应多肽类激素：活化蛋白质或多肽游离羧基形成肽键；与蛋白质或多肽游离羧基缩合形成肽键甾体：经过含游离羧基甾体衍生物与载体蛋白相连抗生素：ß-内酰胺环在偏碱性条件下能够与蛋白质自由氨基以酰胺键形式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实现药品和载体蛋白连接免疫分析法专题知识专家讲座第16页（2）半抗原和载体选择标准

半抗原：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反应微环境；合理利用分子类似物之间交叉反应。载体：载体对监测系统影响；载体效应在免疫过程中影响。免疫分析法专题知识专家讲座第17页（3）合成抗原测定定性测定方法：光谱分析、热力学分析定量测定方法：相对含量测定；绝对含量测定。免疫分析法专题知识专家讲座第18页一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用主要内容免疫分析法专题知识专家讲座第19页免疫分析实际上是一个特殊试剂分析，特点是抗体成为分析试剂。

免疫分析法专题知识专家讲座第20页1、抗体结构与功效

抗体泛指与待测分子特异性结合蛋白质分子，包含免疫球蛋白（immunoglobulin）,受体（receptor）和其它结合蛋白质，主要是免疫球蛋白，惯用是IgG分子.免疫分析法专题知识专家讲座第21页免疫球蛋白基本结构

IgG分子基本结构是由四个肽链组成，二条较小轻链和二条较大重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。

免疫分析法专题知识专家讲座第22页抗体基本结构免疫分析法专题知识专家讲座第23页IgG分子由四条多肽链组成，以二硫键相连，有三个功效区。抗体在Fab区结合抗原分子，同时经过hi区转动以适应不一样距离抗原决定簇。与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上活性位点，从而表现出固定和激活补体以及粘结单核细胞等亲细胞反应功效。Fab：抗原结合片段Fc：可结晶片段免疫分析法专题知识专家讲座第24页胃蛋白酶木瓜蛋白酶巯基乙醇还原免疫分析法专题知识专家讲座第25页胃蛋白酶（pepsin）水解片段

裂解部位，铰链区H链间二硫键（C端）裂解片段，F（ab’）2，无Fc片段与抗原结合可发生凝集反应免疫分析法专题知识专家讲座第26页木瓜蛋白酶（papain）水解片段

裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端）裂解片段，2个Fab（54KD），一个Fc（50KD）,Fab与抗原结合，不发生凝集反应。

免疫分析法专题知识专家讲座第27页2．抗体作为分析试剂评价

抗体特异性是无与伦比，不需或只需要简单预处理。有较高稳定性。这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一基础。另外，抗体还有一个独特性质：每个抗体分子有两个抗原结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备分析信号反差。

免疫分析法专题知识专家讲座第28页3、抗体制备（1）常规抗血清（多克隆抗体）：指人工被动免疫后制成多克隆抗体，是免疫分析中主要工具。免疫原制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清分析判定。免疫分析法专题知识专家讲座第29页免疫原制备免疫原由质量好抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度免疫原。弗氏佐剂是由一定量羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度分支杆菌混合而成，经研磨到达油包水程度。不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。免疫分析法专题知识专家讲座第30页动物免疫通常免疫动物为家兔和羊。免疫部位多采取脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。免疫抗原量通常为1~10mg或50~100mg。免疫分析法专题知识专家讲座第31页试血及效价测定家兔试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。不一样稀释度抗血清和1%血细胞悬液按1:1混合，37℃保温2h后观察血细胞凝聚情况，即可测得免疫血清效价。免疫分析法专题知识专家讲座第32页（2）单克隆抗体单克隆抗体是建立在经细胞融合而取得杂交瘤细胞基础上。所取得抗体含有均一特异性。高度均质性特异性抗体，由一个识别单一抗原表位B细胞克隆所分泌。普通来自杂交瘤细胞细胞培养法&接种动物体内生产法免疫分析法专题知识专家讲座第33页制备步骤免疫分析法专题知识专家讲座第34页2、抗体纯化利用化学方法提纯或浓缩某一类免疫球蛋白。利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性抗体。免疫分析法专题知识专家讲座第35页3、特异性抗体筛选与效价测定抗体效价又称滴度，指某一物质与一定容量另一物质产生反应所需要量。免疫分析中，免疫血清中抗体效价指将血清稀释，测定与一定抗原能发生反应最大稀释度，此最大稀释度即为血清效价。惯用效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和ELISA法等。免疫分析法专题知识专家讲座第36页一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用主要内容免疫分析法专题知识专家讲座第37页四、免疫分析方法及其应用放射免疫分析法（RIA）荧光免疫分析法（FIA）克隆酶给予体免疫分析法（CEDIA）酶联免疫吸附分析法（ELISA）免疫分析法专题知识专家讲座第38页放射免疫分析法（radioimmunoassay,RIA）1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标识抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法显著提升，而且标准曲线测量范围也显著扩大。因为特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更加快发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法愈加完善。放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广一类竞争性体外放射分析技术.免疫分析法专题知识专家讲座第39页基本原理

基本原理：放射性标识抗原与非标识抗原（包含标准抗原或待测抗原）与有限量特异性抗体发生可逆性竞争结合,这种竞争可用以下反应式来表示：抗原

抗体惯用标识物：125I和氚标识物放射性活度（贝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰变比活度（Bp/g）：每单位质量所含放射性比活度游离状态结合状态免疫分析法专题知识专家讲座第40页详细步骤

抗原抗体反应结合和游离放射性物质分离放射性活度测定柱色谱法吸附法沉淀法抗抗体发微孔滤膜法固相法求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）免疫分析法专题知识专家讲座第41页荧光免疫分析法（Fluorescenceimmunoassay,FIA）免疫荧光技术是将抗原抗体反应特异性和

敏感性与显微示踪准确性相结合一项技术以荧光素作为标识物，与已知抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特征。然后将荧光素标识抗体作为标准试剂，用于检测和判定未知抗原免疫分析法专题知识专家讲座第42页荧光免疫分析法（Fluorescenceimmunoassay,FIA）在荧光显微镜下，能够直接观察展现特异性荧光抗原抗体复合物及其存在部位在实际工作中，因为荧光素标识抗体检验抗原方法较为惯用，所以普通通称为荧光抗体技术免疫分析法专题知识专家讲座第43页依据试验方法分类直接法间接法补体法其它免疫分析法专题知识专家讲座第44页直接法将荧光标识特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检操作简便、特异性高、非特异性染色少敏感性低抗原标识抗体荧光免疫分析法专题知识专家讲座第45页间接法先用已知未标识特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标识抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检未知抗原未标识抗体标识抗体荧光免疫分析法专题知识专家讲座第46页补体法利用补体反应，经过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光补体标识抗补体抗体免疫分析法专题知识专家讲座第47页时间分辨荧光免疫测定利用含有双功效基团结构螯合剂，将镧系元素标识到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，因为镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合成份后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。免疫分析法专题知识专家讲座第48页基本原理它采取抗原与抗体特异反应将待测物与酶连接，然后经过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定对象能够是抗体也能够是抗原。在这种测定方法中有3种必要试剂：①固相抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标识抗原或抗体（标识物）③酶作用底物（显色剂）酶联免疫吸附分析法（ELISA）免疫分析法专题知识专家讲座第49页免疫分析法专题知识专家讲座第50页双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。

它是检测抗原最惯用ELISA，适合用于检测分子中含有最少两个抗原决定簇多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物形成量与待测抗原含量成正比。测定复合物中酶作用于加入底物后生成有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。