酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验第1页试验九酶联免疫吸附试

（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）酶联免疫吸附试验第2页试验目标1.掌握酶联免疫吸附试验原理、种类和用途。

2.学习用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）方法。

3.了解HBsAg阳性意义。酶联免疫吸附试验第3页试验原理用酶来标识抗原或抗体免疫分析分析技术。因为酶高效生物催化作用，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。酶联免疫吸附试验第4页试验原理

将已知抗体（或抗原）结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体（或酶标抗原）按不一样时骤与固相载体表面吸附抗体（或抗原）发生反应，用洗涤方法分离抗原抗体复合物和游离物成份，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。

酶联免疫吸附试验第5页试验原理ELISA基础原理有三条：

（1）抗原或抗体能以物理性（疏水性）地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可经过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与对应抗原或抗体结合后，可依据加入底物颜色反应来判定是否有免疫反应存在，而且颜色反应深浅是与标本中对应抗原或抗体量成正百分比，所以，能够按底物显色程度显示试验结果。

酶联免疫吸附试验第6页试验原理常见酶联免疫吸附试验有间接法竞争法双抗体夹心法酶联免疫吸附试验第7页ELISA-间接法此法是检测抗体最常见方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。

酶标抗体固相抗原待测抗体EEE

ELISA间接法示意图底物酶联免疫吸附试验第8页用于抗原及半抗原定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最终结合于固相酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEEELISA-竞争法

酶联免疫吸附试验第9页ELISA-双抗体夹心法双抗体夹心法常见于检测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含对应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。酶标抗体固相抗体待测抗原EEE

双抗体夹心法检测抗原酶联免疫吸附试验第10页试验材料1、乙型肝炎病毒表面抗原诊疗试剂盒定性检测人血清或血浆中乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包含：HBsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上

HBsAg阴、阳性血清各1份、酶标抗体（二抗）1份，显色剂A、B各1份，终止液1份，洗涤液1份，2、待检血清5份3、微量加样器（10-100ul）及匹配枪头4、废液缸注意：有污染性。酶联免疫吸附试验第11页夹心法检测HBsAg方法

因为抗体1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。1、加样：每组2条8孔，待检8孔，阴性对照、阳性对照、空白对照各1孔。分别加75ul待测样本和阴、阳性对照于对应孔内，盖封板膜，置37℃恒温箱温育60分钟。

2、加酶标抗体：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板，置37℃水浴箱温育30分钟。

3、洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最终一次在吸水纸上拍干。

4、显色：每孔加底物液A、B各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃避光显色30分钟，肉眼观察。

5、终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。在10分钟内酶标

6、测定：用酶标仪（波长450nm）测定各孔吸光度OD值。

酶联免疫吸附试验第12页酶：辣根过氧化物酶(HRP)底物：3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M

H2SO4终止反应，在

450nm测定吸光度。酶联免疫吸附试验第13页结果判断

1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。2、P/N值≥2.1者判为HBsAg阳性；P/N值＜2.1者判为阴性。介于中间为可疑。S：待测样本OD值COV：cut-offvalue=NCx+0.100NCx：阴性对照OD值均值阳性判定值=S/COV≧1.0：阳性﹤1.0：阴性酶联免疫吸附试验第14页酶联免疫吸附试验第15页试验汇报1、计算5个待测样本S/COV，判断结果2、本试验中采取酶、底物及反应原理。酶联免疫吸附试验第16页试验十IgG分离和纯化酶联免疫吸附试验第17页试验目标实践IgG分离纯化过程了解分离、纯化抗体原理比较成年牛血清与新生牛血清中IgG含量（眼观）酶联免疫吸附试验第18页试验原理利用蛋白质盐析原理，分离血清中IgG:

不一样蛋白质在同一浓度盐溶液中溶解度不一样，所以，可利用不一样浓度盐溶液使血清中各个蛋白质成份分别析出。酶联免疫吸附试验第19页血清蛋白质：复杂混合物。1、白蛋白、a1、a2、β球蛋白，纤维蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝细胞合成。2、γ球蛋白主要来自浆细胞。免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。免疫球蛋白能够分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。酶联免疫吸附试验第20页普通pH7.0时，50％硫酸铵饱和度可将全部5种Ig（球蛋白）沉淀出来。33％饱和度大个别IgG可沉淀出来。意义：制备出纯化IgG，可用于酶标抗体或荧光抗体制备。酶联免疫吸附试验第21页试验器材1．动物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2．硫酸铵饱和溶液、0.01mol/LPBS3．冰箱、离心机、电磁搅拌器、天平、尼龙绳等。

酶联免疫吸附试验第22页试验步骤1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/LPBS稀释，搅拌下逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液2Xml（4ml），边加边搅拌，4℃静置30分钟以上，使其充分沉淀。2.离心：3000～4000r/min离心20min，弃上清。3.以0.01mol/LPBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入饱和(NH4)2SO4X/2ml（2.5ml)。置4℃，30～60分钟。4.再离心：3000r～4000r/min离心20min，弃上清。5.重复上述第3、4步骤1－2次，可得到