动物体细胞核移植技术专家讲座

动物体细胞核移植技术动物体细胞核移植技术专家讲座第1页教学目标新课标要求简述动物细胞培养过程、条件及应用。简述经过动物体细胞核移植技术克隆动物过程和应用前景。教学重点动物细胞培养过程及条件。用动物体细胞核移植技术克隆动物过程。教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物过程。动物体细胞核移植技术专家讲座第2页动物胚胎或幼龄动物组织、器官细胞悬浮液（原代细胞）10代细胞40~50代细胞无限增殖传代培养单个细胞加培养液原代培养胰蛋白酶剪碎细胞株细胞系原代培养：第1代细胞传至10代左右传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，分装到两个或两个以上培养瓶中继续培养。细胞株：10到40、50代细胞，遗传物质没发生改变。细胞系：超出50代细胞，遗传物质发生改变，失去接触抑制，可无限增殖。回顾：等同于癌细胞动物体细胞核移植技术专家讲座第3页寻根问底1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物质主要是什么成份？用胃蛋白酶行吗？

细胞间成份主要是蛋白质。

不行，胃蛋白酶适宜PH约为2，当PH>6时，胃蛋白酶就会失去活性，而胰蛋白酶适宜PH为7.2---8.4，多数动物细胞培养适宜PH为7.2---7.4。胃蛋白酶在此环境中没有活性，胰蛋白酶在此环境中活性较高，所以胰蛋白酶适宜用于细胞培养时消化。

2.胰蛋白酶真不会把细胞消化掉吗？为何？

细胞膜成份：磷脂和蛋白质

长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用。

所以必须控制好胰蛋白酶消化时间。3.当前使用或冷冻保留正常细胞为几代以内？

10代以内，以保持细胞正常二倍体核型。动物体细胞核移植技术专家讲座第4页5、为何培养前要将组织细胞分散成单个细胞？6、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？成块组织不利于培养，分散了并制成细胞悬浊液，利于细胞与培养液充分接触，利于培养。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多。动物细胞培养目标是取得细胞或细胞产品。4、为何选取动物胚胎或幼龄个体器官或组织做动物细胞培养材料？分化程度低,分裂和增殖旺盛，易培养思索动物体细胞核移植技术专家讲座第5页一、动物细胞培养条件1、无菌、无毒环境2、营养

3、温度和PH

温度36.5+0.5度，pH7.2～7.44、气体环境

O2和CO2（95%空气和5%CO2）维持培养液PH培养液和全部培养用具进行无菌处理办法：培养液中加一定量抗生素。葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子（维生素、激素等）和

动物血清较植物组织培养基，动物细胞培养液独特之处？①液体培养基②成份中有动物血清等动物体细胞核移植技术专家讲座第6页想一想为何对动物细胞进行培养时要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质为白蛋白和球蛋白；氨基酸有各种，是细胞合成蛋白质基本成份，有些动物细胞不能合成，必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等促进细胞生长、增殖、贴附，还有很多未知促细胞生长因子等其它活性物质。所以，细胞培养要确保细胞能顺利生长和繁殖，普通要添加10%----20%血清。动物体细胞核移植技术专家讲座第7页二、动物细胞培养技术应用1.生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等2.基因工程技术中受体细胞。3.用于检测有毒物质。4.培养正常或病变细胞，用于生理、病理、药理等方面研究。可用于健康细胞培养，如取得大量本身皮肤细胞，用于植皮；用于筛选抗癌药品等，为治疗和预防疾病提供理论依据动物体细胞核移植技术专家讲座第8页细胞全能性细胞株、细胞系植物体或组织培养结果取得细胞或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目标葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成份液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养比较动物体细胞核移植技术专家讲座第9页

动物细胞特点？分化潜能变窄：伴随细胞分化程度提升而逐步受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。细胞核仍含有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，所以高度分化细胞细胞核仍含有全能性想一想？动物体细胞核移植技术专家讲座第10页

依据动物细胞核仍含有全能性特点,怎样将动物细胞全能性表示?

利用动物体细胞核移植技术再想一想？动物体细胞核移植技术专家讲座第11页动物核移植：

将动物一个细胞细胞核，移入一个已经去掉细胞核卵母细胞中，使其重组并发育成一个新胚胎，这个新胚胎最终发育为动物个体。

用核移植方法得到动物成为克隆动物。三、动物体细胞核移植技术动物克隆包含两个过程：核移植和胚胎移植克隆=无性繁殖动物体细胞核移植技术专家讲座第12页1.分类黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊子宫妊娠、出生克隆羊多利核移植分类体细胞核移植胚胎细胞核移植易难2、过程动物体细胞核移植技术专家讲座第13页（MⅡ卵母细胞）减数第二次分裂中期去核卵母细胞供体细胞注入去核卵母细胞受体细胞激活，完成细胞分裂、发育胚胎移植重组胚胎代孕母牛出生与供体奶牛遗传物质基本相同牛动物体细胞核移植技术专家讲座第14页供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵母细胞（MⅡ中期：供质）去核无核卵母细胞注入细胞融合重组细胞重组胚胎胚胎移植代孕母体供体奶牛遗传基础相同牛◆取去核卵细胞作受体细胞原因是:

细胞质内存在激发细胞核全能性表示物质卵黄多，营养物质丰富

体积大,易操作

◆此试验应用到技术：

电脉冲刺激动物细胞培养、动物体细胞核移植、胚胎移植动物体细胞核移植技术专家讲座第15页①.在体细胞细胞核移植到受体卵母细胞之前，为何必须先去掉受体卵母细胞核？为了使核移植胚胎或动物遗传物质全部来自有主要利用价值动物提供体细胞。②.用于核移植供体细胞普通都选取传代10代以内细胞，想一想，这是为何？10代以内细胞普通能保持正常二倍体核型，能确保供体细胞正常遗传基础。思索与讨论动物体细胞核移植技术专家讲座第16页③.你认为用上述体细胞核移植方法生产克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%复制吗？为何？不是，克隆动物线粒体中DNA是来自于受体卵母细胞。

另外，即便动物遗传基础完全相同，但动物一些行为、习性形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活环境与克隆动物所生活环境不会完全相同，其形成行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%复制。思索与讨论动物体细胞核移植技术专家讲座第17页3.体细胞核移植技术应用前景①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。②保护濒危物种③可作为生物反应器，生产医用蛋白；

克隆动物细胞、组织、器官可作为异种移植供体；人核移植胚胎干细胞经过诱导分化，用于组织器官移植；

了解胚胎发育及衰老过程；

做疾病模型等畜牧业、医药卫生以及其它领域有着广泛应用前景动物体细胞核移植技术专家讲座第18页4.体细胞核移植技术存在问题出生率非常低＜10％克隆动物存在着健康问题克隆动物食品安全性问题存在争议动物体细胞核移植技术专家讲座第19页2.动物细胞培养有各种用途，普通而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时脱分化过程了。

要想使培养动物细胞定向分化，通常采取定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要组织或器官。P50思索与探究动物体细胞核移植技术专家讲座第20页3.（1）提醒：能够用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达产奶量很高，说明它有高产奶遗传基础，利用卢辛达体细胞克隆奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛含有高产遗传基础，假如精心培育和喂养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产公牛自然繁殖，可得到很多高产后代，从而加紧奶牛改良进程。

但同时需注意，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限繁殖，以防止奶牛群出现近亲繁殖而引发种质衰退。(2)提醒：首先从卢辛达耳朵（也可用别组织、器官，耳朵在活体上轻易取）上剪