基因工程原理

基因工程原理基因工程原理第1页一．DNA限制酶反应

1.酶单位定义:

使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需限制酶活性。

2.酶切反应类型

1)完全酶切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)

2)个别酶切

3.酶切反应最适条件

1)DNA分子组成

i.碱基组成与排列方式

ii.识别位点两侧碱基组成与排列方式，同一DNA分子中不一样识别位点酶切速度可相差10倍（如λ中EcoRI位点）

2)反应条件

i.DNA溶液纯度和浓度（反应浓度）依试验目标而定HpaI(CCGG)126ThaI(CGCG)023基因工程原理第2页

ii.限制酶纯度和稳定性

i)纯度：尽可能保持厂家推荐反应条件

ii)稳定性：保留和反应

iii.反应缓冲液：常见三种关键缓冲液，即高（H），中（M），低（L）盐缓冲液，不一样温度下pH值

iv.反应温度：大多数为37℃

v.

双酶切和多酶切反应同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生个别酶切反应，便无法判断是何种酶造成，所以最好采取后者--分别酶切。

i)第一个酶切电泳检验酚/氯仿纯化第二种酶切。可不考虑酶切先后次序，但操作步骤多。

ii)采取低浓度盐缓冲液限制酶切电泳检验采取高浓度盐缓冲液限制酶切。操作简单，但要分先后。假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑则是相互间酶切是否有影响，两种酶切次序不一样时，其结果大不相同。

如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)基因工程原理第3页二、限制酶图谱绘制

1.完全酶切作图法

1）单酶切作图法一长度为5Kb线状DNA分子用两种限制酶完全酶切凝胶电泳结果和各位点可能性排列。要确定其位置，可采取下述辅助方法之一。

i.单酶个别酶切：个别酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。基因工程原理第4页ii.末端标识完全酶切

DNA片段末端标识完全酶切凝胶电泳EtBr染色观察放射自显影

2)

双酶切作图法单酶切结果只能确定一个酶位点，要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行基因工程原理第5页分别作图时，同一个酶两种作图法都是正确，但看成在一张图上时，上述两种可能性中只有一个是正确，所以必须进行双酶切反应，其结果见图依据上述原理和步骤，前述5Kb片段酶I与酶II定位结果可用两种方法之一：

i)单酶切分离DNA片段第二种酶切凝胶电泳

ii)单酶切第二种酶切凝胶电泳*假如要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时，单酶完全酶切作图就没必要了。

基因工程原理第6页

2.末端标识-个别酶切作图法（Smith-Brinstiel法）

DNA片段末端标识酶1切分离带标识DNA片段酶2个别酶切电泳EtBr染色摄影放射自显影结果单端标识方法:

人工合成单端标识法

限制酶切单端标识法基因工程原理第7页单端标识方法1

人工合成单端标识法基因工程原理第8页单端标识方法2

限制酶切单端标识法基因工程原理第9页

3.末端标识双相作图法方法2仍存在两个不足之处：①酶1选择不能靠近DNA中央；②需先分离DNA片段，该法可克服上述缺点。现假设有一片段长10Kb，其中RE1有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是:基因工程原理第10页4.Bal31次序酶解作图法

DNA片段Bal31处理不一样时间取样终止反应限制酶切凝胶电泳染色观察结果5.切口移位作图法(可检测出100bp片段)

双链DNA切口移位限制酶切电泳放射自显影基因工程原理第11页6.大尺度限制酶作图

1)

条件

i.

电泳方法脉冲场凝胶电泳

ii.

样品制备原位DNA制备和酶解

iii.

人工染色体构建pYAC载体构建

iv.

脊椎动物基因组中CpG和植物基因组中CpXpG序列存在

2)

普通作图程序原位DNA样品制备原位DNA限制酶切脉冲场凝胶电泳染色观察

3)

大尺度作图用酶

i.

稀有识别序列内切酶I型内含子内切酶(真菌细胞核和线粒体基因组,T4噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体)；酵母HO内切酶；大肠杆菌recA

即使这些内切酶识别序列都很长：10-19bp，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而极少使用基因工程原理第12页

ii.

II型限制酶人基因组有45,000个CpG岛,一个长度约为1.5kb富含GCDNA片段,其中只有25%CpG岛未被甲基化,这些CpG岛常位于基因5’-端,未被甲基化CpG岛平均长约270kb

可用于大尺度限制酶作图限制酶含有以下特征：识别8或6bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列

i)

AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGCii)

FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGCiii)

SfiI-GGCCNNNNNGGCCiv)

CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCGv)

BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGGvi)

NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGGvii)

MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,

SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH3基因工程原理第13页三.

限制酶图谱用途

1.

基因工程中应用

1)

克隆载体图谱,便于DNA重组;2)

克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,基因定位,核酸定序.

2.

突变体检测遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,所以必定发生了基因型和表型改变.

限制酶图谱无须依赖表型改变,酶谱改变一定是基因型发生了改变,但不一定发生了表型改变,即表型改变不一定会造成酶谱改变.1)

缺失突变体检测:某DNA片段消失,代之以一较小DNA片段.2)

插入突变体检测:某DNA片段消失,代之以一较大DNA片段.基因工程原理第14页缺失和插入突变体检测（I）III点突变检测（II）基因工程原理第15页3）点突变检测:某DNA片段消失,代之以两较小DNA片段.前者长度等于后二者长度之和(位点增加)；某两DNA片段消失,代之以一较大DNA片段，前者长度之和等于后者长度(位点消失).

3.

重组频率测定同一染色体座位上等位基因可能含有不一样表型,从而组成遗传多型性.等位基因限制酶谱也可能含有多型性,这就是限制酶片段长度多型性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不一样个体总DNA限制酶完全酶切Southern印迹杂交结果分析基因工程原理第16页

当不一样个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不一样果蝇交配时,其后代表型和限制酶谱可为:表型红:白=1:1,限制酶谱30%个体已发生了重组.4.

遗传疾病诊疗分析正常人与遗传病患者一些DNA片段限制酶谱,便可发觉其差异,并总结出各种遗传疾病限制酶长度多态性图。临床诊疗时，将遗传病可疑患者限制酶谱与之比较,便可判断其是否患有此病.基因工程原理第17页第五节DNA连接

基因工程原理第18页一.DNA连接方法两种不一样DNA分子能够经过下述方法之一进行连接,而方法选取则是依据其二者末端DNA结构.1.直接连结法该法适合用于:1)

同种限制酶作用不一样DNA片段产生相同粘性末端

重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列限制酶除外(如AraI)2)不一样种限制酶作用不一样DNA片段产生相容性末端

i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重组DNA分子可为其中一个酶所作用,但为另一个酶作用可能性较小,如MboI/BamHI3)PCR产物与特定载体连接

4)限制酶和其它方式产生平整末端.基因工程原理第19页2.人工接头连接法1)人工接头（linker）结构

i.中轴对称互补,可自行退火形成双链.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.最少有一特定限制酶识别位点

iii.某种限制酶一套人工接头可使插入片段与表示载体保持同相.如:

八聚体d(GGAATTCC)

十聚体d(CGGAATTCCG)

十二聚体d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端连接(各种结构DNA末端均可经过修饰变成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火基因工程原理第20页ii.产生新克隆位点

iii.合成匹配接头3)连接方法

人工接头磷酸化退火形成双链与目标DNA相连限制酶切两DNA分子相连4)适用范围

人工接头连接法适合于那些只有一个DNA片段需加人工接头就能够与另一DNA分子相连DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端DNA分子相连.这种直接相连方法简便,快速,但最终连接起来DNA可能含有不一样结构.为防止这些结构产生,可先使一个DNA先加上人工接头后,再与另一个DNA分子相连.基因工程原理第21页3.匹配接头连接法人工接头即使可连接两个具不一样末端DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时试验不允许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不一样末端DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接头结构特点

i.

由两个低聚核苷酸组成

ii.个别区域能够互补

iii.退火后双链低聚核苷酸能够形成两个不一样末端2)

匹配接头种类基因工程原理第22页i.

预制匹配接头(连接平端和粘性末端)

人工接头+匹配接头预制匹配接头

ii.转换匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接头退火转换匹配接头二人工接头连接酶双酶切转换匹配接头

iii.单链匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾连接法在两个不一样DNA分子末端各加上一个可互补同聚物,即AT或GC.5.连接方法选择方法选择依据:1)两DNA分子末端结构

2)DNA分子限制酶谱

3)是否需要回收DNA片段基因工程原理第23页连接方式选择载体末端外源DNA末端常规连接脱磷酸化同聚物平端连接补齐,人工接头

结构结构载体加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二选择第一选择不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能结合使用接头不能不能第一选择

3’-突起相容3’-突起唯一选择不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一选择不能第二选择或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一选择不能第二选择

(补齐后)

平端平端不能可能可能第一选择可能平端3’-或5’-突起不能不能第一选择不能第二选择基因工程原理第24页二.DNA连接反应

1.

连接反应理论当两种DNA分子相连时,它们可能产生不一样结果,这些结果与以下原因相关:1)

连接反应系统中总DNA浓度i2)

一个DNA分子靠近同一分子另一端有效浓度j,该值与DNA长度成反比,即DNA分子越大,该分子两末端越不易相互作用(即本身环化)3)

两种不一样DNA分子克分子浓度之比值.2.

连接反应条件

1)

评定连接反应结果方法

i.

琼脂糖凝胶电泳

ii.大肠杆菌转化

2)

反应条件基因工程原理第25页i.

温度

ii.ATP浓度

iii.时间

iv.连接酶浓度

v.克分子比率基因工程原理第26页

第六节

PCR技术基因工程原理第27页一．DNA体外扩增技术

1.

PCR反应体系

1)基础原理(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应)

一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增DNA序列有所了解，最少要对其两侧核苷酸序列为已知，方便合成寡核苷酸引物

2)基础操作待扩增DNA片段+dNTP+Tris·HCl缓冲液+两引物90℃变性30″50℃退火30″加入TaqDNA聚合酶75℃1′进入第二次循环25-30次循环基因工程原理第28页PCR原理示意图基因工程原理第29页2.PCR产物判定

1)PCR产物大小和限制酶谱分析2)寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（OR分析，OligomerRestrictionanalysis）

OR分析对于PCR产物限制酶位点上发生了点突变检测极其有用基因工程原理第30页PCR产物OR判定基因工程原理第31页3)分子杂交适合于检测PCR产物非限制酶位点上碱基突变。它是利用两条引物链间特异性DNA片段作探针(常为人工合成一段低聚核苷酸，约20n.t.).当这种探针核苷酸序列与待测DNA核苷酸序列完全互补时才能杂交。假如利用各种等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specificOligonucleotide,ASO）与PCR产物进行杂交，可检测出PCR产物碱基突变。可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析基因工程原理第32页4)核苷酸序列分析

DNA扩增产物变性与末端标识扩增引物或定序引物退火双脱氧核苷酸链终止反应，测定DNA序列基因工程原理第33页二．TaqDNA聚合酶特点

TaqDNA聚合酶是从一个极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。该酶分子量为63-68kD

1.无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切酶活性，但含有依赖于聚合酶活性5’3’外切酶活性

2.最适反应温度为80℃

3.最适pH8.0和最正确反缓冲液Tris·HCl

4.最正确二价阳离子Mg2+

（10mM）

5.具良好热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有70%酶活基因工程原理第34页TaqDNA聚合酶特征基因工程原理第35页当采取TaqDNA聚合酶进行DNA体外扩增时，必须考虑到以下五个参数：

1）热稳定性：在PCR循环中DNA变性时间常为30-60″，若循环30次，其累计加热变性时间为15-30′。TaqDNA聚合酶在90℃下保温30′仍含有70%酶活性，可大大降低操作步骤，易于实现自动化*2）模板与引物特异性：当退火温度和DNA链延伸时温度偏低时，引物与模板配正确特异性大大降低，从而造成一些不需要DNA片段被扩增。显然，其产物专一性大大降低，使结果无法分析。因为TaqDNA聚合酶最适反应温度为80℃，退火温度可提升到55℃以上，由此大大降低了引物与模板非专一性结合，使产物均一性大大增加**3）合成产率：反应底物和产物在DNA扩增中不停发生改变，最终将会造成聚合反应进入平台期，平台期出现时间与聚合酶特征相关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采取TaqDNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可大4×106***4）延伸长度：有时为了获取较长DNA片段扩增，这就要求DNA聚合酶含有较强延伸能力。当扩增片段大于250bp时，Klenow片段和T4聚合酶扩增产率大大降低。利用T7DNA聚合酶，可使扩增片段达2Kb。当利用TaqDNA聚合酶时，最长延伸长度为4.4Kb.基因工程原理第36页

经改造TaqDNA聚合酶可扩增出40kbDNA片段.5）扩增产物可靠性：评定DNA聚合酶一个主要指标是它复制DNA可靠性，即掺入错误碱基频率。这对于PCR技术可靠性是至关主要。Klenow片段错误掺入率为10-4，TaqDNA聚合酶错误掺入率为5×10-3

，而T4聚合酶错误掺入率为10-7。

*注：1）退火温度常与引物长度和碱基组成有直接相关关系，引物越长或GC含量较高，退火温度能够高些，反之则低些。退火温度越高，引物与模板（即扩增DNA）结合特异性越高，这可大大降低非特异性DNA片段扩增。引物长度常为20-28聚体，其中有50%以上GC含量，无本身互补序列，尤其是3'末端不应有内部二级结构，引物加量为每100μll20pmol.**2)出现平台期原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又快速退火，不能与引物结合。***3）链延伸长度与延伸时间相关，对于TaqDNA聚合酶，每分钟可形成n.t.或更多。假如要扩增3-4KbDNA，在72℃下需将酶延伸时间增至3-4分钟。基因工程原理第37页三．PCR方法

1.

强化PCR（BoostedPCR）将PCR分为两个阶段：

1）引物与模板之比为107，扩增20个周期

2）引物与模板之比为1012–1013，再扩增10个周期该法适合于待扩增DNA浓度较低时。

2.混合寡核苷酸引物PCR（mixedoligonucleotideprimedamplificationofcDNA,MOPAC）依据各氨基酸最常见密码子合成一系列引物，对某一特定cDNA进行扩增。

3.锚定PCR(AnchoredPCR，A-PCR)基因工程原理第38页4.连结PCR(ligationmediatedPCR)

该法可用于核苷酸序列测定,DNA足迹分析技术和测定甲基化作用基因工程原理第39页5.不对称PCR(AsymmetricalPCR)采取不一样引物浓度比率，如50：1，100：1，可得大量拷贝ssDNA用于测序6.GC串PCR(GCclampPCR)应用变性剂梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)可检测出DNA片段中一对碱基改变，在DNA分子一端加上一GC串（约40n.t.）利用它高解链温度特征，在梯度变性胶上可检测出原DNA链中最高解链区内点突变基因工程原理第40页

7.竞争引物PCR(competitiveoligonucieotideprimerPCR,COP-PCR)

有一个碱基改变两种引物在较宽松复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。基因工程原理第41页8.等位基因专一PCR(AllelespecificPCR,ASPCR)

该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。9.反转PCR(inverserarinvertedPCR)

该法可用于扩增已知序列两侧未知序列基因工程原理第42页10.反向PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

主要用于mRNAPCR扩增

基因工程原理第43页

11.加端PCR(Add-onPCR)

在合