培养基和灭菌

关于培养基和灭菌第一节培养基成分及其功能碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长因子、前体、诱导剂或刺激剂、抑制剂例：高氏培养基（培养放线菌）：

可溶性淀粉2克，硝酸钾0.1克，磷酸氢二钾0.05克，氯化钠0.05克，硫酸镁0.05克，硫酸亚铁0.001克，琼脂2克，水100毫升。第2页,共59页，2024年2月25日，星期天一、碳源：提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗生素的碳骨架。1．碳水化合物：单糖（葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖），二糖（麦芽糖、乳糖），多糖（蔗糖、淀粉、糊精等）

2．脂肪：油（脂肪）水解脂肪酶

甘油（脂肪酸）溶解氧C02+H20

第3页,共59页，2024年2月25日，星期天3．有机酸有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。注意！有机酸的利用常会使pH上升。

CH3COONa+O2→2CO2+H2O+NaOH第4页,共59页，2024年2月25日，星期天葡萄糖是最容易被吸收利用的碳源，几乎所有微生物都可以利用葡萄糖，葡萄糖可以加速微生物的生长，但葡萄糖浓度过高，反而对生长、产抗生素不利。淀粉、糊精等也是常用的碳源，一般经胞外酶水解成单糖后被吸收利用。第5页,共59页，2024年2月25日，星期天二、氮源：主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。1、无机氮源（快速利用N源）：铵盐（如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝酸钾）和氨水等。特点：（1）分解快，能被微生物迅速利用；（2）引起pH变化。

(NH4)2S04→2NH3+H2S04生理酸性物质

NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH生理碱性物质第6页,共59页，2024年2月25日，星期天2、有机氮源（慢速利用氮源，多为天然有机物）：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢．最终用于合成菌体细胞物质和含氮的目的产物。第7页,共59页，2024年2月25日，星期天三、无机盐、微量元素：

微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物质的组成或代谢的调节物，为微生物提供除C、N源外的各种重要元素。P、S（可构成细胞物质）Mg、Fe（可作为酶的组成成分或维持酶活性）K、Na（调节细胞渗透压）Cu、Zn、Mn（作为酶的辅基和激活剂）第8页,共59页，2024年2月25日，星期天四、水：

（1）构成生物体的成分；（2）培养基的组成部分；（3）参与代谢反应；（4）作为代谢反应介质；（5）作为物质传递介质；（6）良好的热导体。第9页,共59页，2024年2月25日，星期天五、生长因子：生长因子：有些微生物即使在具有合适的水分、碳源、氮源、无机盐等的条件下，还不能生长或生长不好，但如果加入少量微生物生长所必需的有机物质，则生长良好。通常把那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微生物不能通过普通的碳源、氮源合成这些物质，需另外添加的营养物质称为生长因子。1．维生素：是辅酶的组成成分；2．氨基酸：有些生物不能合成某种氨基酸；3．嘌呤和嘧啶：构成核酸和辅酶。第10页,共59页，2024年2月25日，星期天六、前体

在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分，而化合物本身的结构没有大的变化，这些物质称为抗生素的前体。第11页,共59页，2024年2月25日，星期天七、诱导物或刺激剂：

所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成能力的小分子物质，它们是既不是营养物质又不是前体却能提高产物产量的添加剂。如：β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂。第12页,共59页，2024年2月25日，星期天八、抑制剂：抑制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累起来。如加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，从而增加利福霉素B的含量和产量。第13页,共59页，2024年2月25日，星期天第二节培养基的种类

一、按来源分类：1、合成培养基（1）所用原料的化学成分明确、稳定；（2）实验重现性好、低泡；（3）适用于研究菌种基本代谢和过程的物质变化；（4）营养单一，价格昂贵，不适用于大规模工业生产。第14页,共59页，2024年2月25日，星期天2、天然培养基（天然的动植物产品）（1）营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。（2）组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，适用于工业生产。（3）组分复杂，不易重复，若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。LB培养基：1g酵母粉，0.5g蛋白胨，1gNaCl，100mLH2O第15页,共59页，2024年2月25日，星期天二、按状态分类：

固体培养基：适用于菌种的培养和保存；半固体培养基：（琼脂用量为0.5～0.8％）主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等；液体培养基：（水80％～90％），是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质的传递。

第16页,共59页，2024年2月25日，星期天三、按用途分类：

1．孢子培养基供菌种繁殖孢子的固体培养基。能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引起菌种发生变异。例如：高氏培养基第17页,共59页，2024年2月25日，星期天2．种子培养基指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮和使各种有关的初级代谢酶的活力提高。赤霉素产生菌种子培养基：葡萄糖1.5%,糊精1.0%,花生粉1.5%,MgSO4·7H2O0.1%,KH2PO40.1%,消泡剂0.2%第18页,共59页，2024年2月25日，星期天3．发酵培养基发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。玉米淀粉7.0％，饴糖2.5％，豆饼粉0.3％，花生粉1.0％，MgSO4·7H2O0.07％，KH2PO40.14％，消沫剂0.05％，α-淀粉酶0.05％第19页,共59页，2024年2月25日，星期天第三节影响培养基质量的因素

一、原材料质量的影响：玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、糊精品种、产地、加工方法、储藏条件

第20页,共59页，2024年2月25日，星期天二、水质的影响地质（地区）（地貌）、季节、处理方法（漂白粉、沉淀剂、消毒剂）和环境水源质量的主要考虑参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。

第21页,共59页，2024年2月25日，星期天三、灭菌操作灭菌操作不当不仅会减少培养基中有效的营养成分，还会产生一些有毒物质，给发酵带来不利的影响。蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活葡萄糖与含氨基的物质反应形成5-羟甲基糖醛和棕色的类黑精（焦化），对微生物有一定的毒性第22页,共59页，2024年2月25日，星期天四、培养基粘度的影响粘度是培养基物性的重要指标之一，它直接影响氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩散，从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收，最终导致影响目标产物的形成。“稀配方”：（1）中间补料；（2）精料发酵、基础原料液体化；（3）补加无菌水第23页,共59页，2024年2月25日，星期天第四节培养基配置的原则

一、碳氮源种类的确定原则快速利用碳氮源、慢速利用碳氮源的种类、配比要满足不同微生物，不同生长阶段和生产阶段的需要。例：顶头孢霉（头孢菌素c），葡萄糖有利于菌体生长，而半乳糖对抗生素生产有利。

第24页,共59页，2024年2月25日，星期天二、碳氮源比例的确定原则

1、氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。2、碳源过多，则容易形成较低的pH；若碳源不足，则易引起菌体衰老和自溶。3、碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成。4、C/N比等应与环境因素结合考虑。第25页,共59页，2024年2月25日，星期天三、培养基配置与pH之关系原则酸性抗生素发酵环境一般呈酸性（pH<7），中性及碱性抗生素发酵环境一般呈中碱性（pH>=7）。配置培养基时，生理酸碱性原料应合理搭配。第26页,共59页，2024年2月25日，星期天四、保证源副材料质量的稳定性原则培养基中各组分质量的稳定性是获得连续、高产的关键。定点采购、定点加工、稳定加工工艺、恒定的贮存条件、预试验。第27页,共59页，2024年2月25日，星期天第五章思考题1、培养基在抗生素发酵中的作用如何？2、培养基的种类及其特点是什么？3、培养基的成分及其在抗生素发酵中的功用是什么？4、影响培养基质量的因素有哪些？5、培养基配制的原则？第28页,共59页，2024年2月25日，星期天第六章

灭菌及染菌防治

染菌对抗生素生产过程的危害：（1）消耗培养基的营养成分；（2）使培养条件如溶氧、粘度发生变化；（3）有的杂菌会分泌一些对抗生素产生菌有毒或能使抗生素降解失活的物质，从而造成抗生素产量大幅度下降；（4）影响后道工序的正常生产、影响产品外观及内在质量；（5）如果污染了噬菌体，不仅引起产生菌自溶，而且还会迅速大面积蔓延，严重威胁抗生素的生产。第29页,共59页，2024年2月25日，星期天第一节灭菌的理论和技术灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命有机体的过程。一、物理灭菌射线灭菌热灭菌（湿热和干热）过滤除菌第30页,共59页，2024年2月25日，星期天

（一）射线灭菌1、方法：通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌。其中以紫外线最常用。2、原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸收光谱相一致，DNA链上核苷酸的碱基因此具有强烈的吸收紫外线的能力，引起DNA结构形式的变化而导致死亡。3、特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力极低，只能用于表面灭菌。对真菌孢子的杀灭能力不大。主要用来进行一定空间内空气的灭菌（如无菌室等）。第31页,共59页，2024年2月25日，星期天（二）干热灭菌

1、方法：包括火焰灭菌和热空气灭菌，常用的干热空气灭菌是利用电热或者红外线在一定设备内对各种用具物品进行杀菌。生产上常用的干热灭菌的条件是160℃，时间1－2h。2、原理：高温时微生物各种与温度有关的氧化过程速率增快。3、特点：时间长、耗热量大，应用不广。一般用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。第32页,共59页，2024年2月25日，星期天（三）湿热灭菌1、方法：直接用加压湿蒸汽进行物料或设备容器的灭菌。用蒸汽将物料升温到115－140℃保持一定时间，可杀死各种微生物。常用的灭菌条件是120℃，20－30min。2、原理：在高温及有水分存在的条件下，微生物细胞中的蛋白质极易凝固而引起微生物的死亡。3、特点：经济，快速，适用于大量培养基及发酵设备的灭菌。第33页,共59页，2024年2月25日，星期天（四）介质过滤除菌对培养液中某此不耐热的成分可采用过滤除菌法。发酵过程中所用的大量无菌空气也是用过滤除菌法。第34页,共59页，2024年2月25日，星期天二、化学灭菌

1、定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞接触而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。2、灭菌用化学药剂必须具备以下四个条件：（1）杀菌谱广。有效浓度低且杀灭微生物的速度快。（2）性质稳定，易溶于水且可在常温下使用。（3）基本上不受有机物、酸、碱和其他物理化学因素的影响。（4）无腐蚀性，无毒或低毒，使用安全。第35页,共59页，2024年2月25日，星期天3、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。4、用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、器具及无菌区域的灭菌，很少用于培养基的灭菌。第36页,共59页，2024年2月25日，星期天第二节培养基及有关设备的灭菌

一、实罐灭菌

分批灭菌是将配制好的培养基投入发酵罐中，经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸汽使培养基和设备一起灭菌。流程：培养基预热培养基灭菌冷却第37页,共59页，2024年2月25日，星期天第38页,共59页，2024年2月25日，星期天注意事项：1．培养基预热：80～90℃。避免产生冷凝水造成培养基稀释。2．培养基灭菌：120～130℃，保温30min。各路蒸汽进口要畅通，防止逆流，罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。排汽量不宜过大，以节约蒸汽用量。3．冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。第39页,共59页，2024年2月25日，星期天（一）实罐灭菌

优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，操作简单，灭菌效果可靠。

缺点：设备利用率较低；灭菌过程需要时间较长，培养基营养成分破坏较多。

该法多用于中小型发酵罐和种子罐的灭菌。第40页,共59页，2024年2月25日，星期天二、空罐灭菌空罐灭菌是指将饱和蒸汽通入未加培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。空罐灭菌一般维持罐压1.5×105～2.0×105Pa，罐温125～130℃，30～45min，直接蒸汽法。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。第41页,共59页，2024年2月25日，星期天（二）空罐灭菌

优点：罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。

适用范围：没有使用的发酵罐、染菌罐、发酵罐更换菌种、培养基连续灭菌工艺、发酵罐及附属设备。第42页,共59页，2024年2月25日，星期天三、连续灭菌培养基在发酵罐外，通过专用灭菌装置，连续不断加热，维持保温和冷却后，送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，又称连消。流程：培养基预热连续灭菌维持灭菌温度冷却发酵罐第43页,共59页，2024年2月25日，星期天注意事项：1．培养基预热：60一75℃，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。2．连续灭菌：连续灭菌的温度一般以126一132℃为宜。3．维持灭菌温度：利用维持罐使料液在灭菌温度下保持5—7min，以达到灭菌的目的。4．冷却：采用冷水喷淋时，喷淋前冷却管内应充满填料。第44页,共59页，2024年2月25日，星期天特点：（1）连续灭菌的时间短、温度较高。培养基受到的破坏较少，故质量较好。连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致。（2）不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。第45页,共59页，2024年2月25日，星期天四、发酵附属设备及管路的灭菌

发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。空罐灭菌使罐内蒸汽压力达到1.5×105Pa，保温45min。补料罐的实罐灭菌条件应视物料性质而定。第46页,共59页，2024年2月25日，星期天第三节空气过滤除菌抗生素产生菌一般都是好氧菌,所以发酵过程中必须通入无菌空气来满足产生菌生理上的需要。如果空气除菌不当或除菌设备失效,就会引起大面积染菌,造成极大的损失。因此,空气除菌是抗生素发酵生产极其重要的一环。第47页,共59页，2024年2月25日，星期天第三节空气过滤除菌

一、介质除菌的机制

1．沉降作用2．截留作用

3．惯性碰撞4．扩散现象5．静电吸附第48页,共59页，2024年2月25日，星期天二、空气过滤介质1、要求：能耐高温、高压，不易被油水污染。且成本低、易更换。2、常用的空气过滤介质：棉花、活性炭、玻璃棉、超细玻璃纤维纸、石棉滤板等。3、新型过滤介质：膜过滤器。第49页,共59页，2024年2月25日，星期天折叠式膜过滤器：设备体积小，过滤效率高，操作、维修、更换方便，效果较好。其滤膜采用进口聚四氟乙烯膜,滤膜孔径小，截留能力强；孔隙率高，流速快，流量大;滤膜吸附性小；气体过滤精度能100%滤除0.02μｍ以上微粒(包括0.02μｍ～0.45μｍ的细菌和0.04μｍ的噬菌体)。第50页,共59页，2024年2月25日，星期天三、空气过滤除菌的工艺过程

主要目的：1、提高压缩前空气的质量2、去除压缩空气中所带的油和水3、获得无菌空气第51页,共59页，2024年2月25日，星期天第四节发酵染菌的原因及防治一、种子带菌接种瓶中剩余的少量种子液继续进行培养，以观察判定是否为种子带菌。制备种子时对沙土管、冷冻管、斜面及摇瓶进行严格控制。第52页,共59页，2024年2月25日，星期天二、设备及附件渗漏1、化学腐蚀使用耐腐蚀材料、防腐涂料等降低或防止化学腐蚀。2、电化学腐