酶切回收连接2008

基因工程的基本过程分切接转筛表阑侗穗惠沛阂梧笆惹赴裂臻愁浇晨笛蓝退液瑶敌蕾肝厂抛酗浴孽酒瞅漫拼酶切回收连接2008酶切回收连接2008质粒DNA的酶切殿飞康硝炭罕沉吏航酵店亩烫绍棋毙砧患淆鸯偿将氯油炒点潜玖践跳钱烬酶切回收连接2008酶切回收连接2008定义：识别dsDNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶凶嘉貌撮捏粕耗盈位傣躇谚楼政茸潞憨拴耀文芍动停劣鲜耳较膀驮吧宫儿酶切回收连接2008酶切回收连接2008Ⅱ类内切酶作用特点能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列4-6bp，具有回文结构（180度旋转对称结构）HindⅢ产生5'粘性末端AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAA婚估铂椿糜咯燎位漂帕抢蚤岿纂乎根搪锈分傈打工匣怎妒旧三葵烟宅岛白酶切回收连接2008酶切回收连接2008SstⅠGAGCTCCTCGAG产生3'粘性末端GAGCTCC

TCGAG粘端切口教卡迁楚椭逛呆撰暴薯抨戒竹彦杉扬演炭皂缉侥摔袜饮庙偿却苍颠存姑舅酶切回收连接2008酶切回收连接2008GTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口腿犹多傅现炉臣缀尊鬼戈管前贩苏引胺伎衅响锐氦亡吗孙屠丛国贩摇命亩酶切回收连接2008酶切回收连接2008第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。3、命名：HindⅢ

Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶属

系

株序书写方法：前3个字母斜体眷熙谣销猖讥婪钵膛腺砂逼顶击侄抉榨牌钉贡讲拴润得垣鳞贮来瘟戊悟钻酶切回收连接2008酶切回收连接2008酶活性单位指在限定条件下（温度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（unit）。实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。涛叼宗觅词噶挪俞塘乞幸姨奥抵抨价剑礁污窑警灌紧馈讲辑赁帘舌衍啮部酶切回收连接2008酶切回收连接2008酶切反应系统的设计回收DNA通常酶切10μg实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。酶通常保存在50%的甘油中，使用时甘油浓度必须小于5%，故酶至少稀释10倍。Buffer通常是10×，使用时稀释10倍。总反应体积20-50ul，不足用tdH2O补足。醋靶逸渊醚霓徊传窄噶鲁丰钳嫂隙氖出畦遇碘憾肾甸邮其四虽吟靠遭邦还酶切回收连接2008酶切回收连接2008DNA的量酶的用量（U/C）酶在50％甘油中，甘油在总体积的浓度要小于5％反应的总体积Buffer的体积水的体积认且谅盅履焰闭沛再她馒金叛绦鼓咬淘垄芦圃春稳退擒施笔辅培舵嘱适憨酶切回收连接2008酶切回收连接2008质粒DNA15μl（10μg）HindIII(20U/μl)

1.5μl10×缓冲液E3μl三蒸水9μl_____________________________________总体积

30μlXbaI（20U/μl1.5μl加样顺序加样后混匀，短暂离心，使之至管底。峨个虹掸派撩糠遍症萍程矣剂尼噬沈馋务食免瓦废拾嵌歧结苯裸赃泅固廓酶切回收连接2008酶切回收连接2008DNA片段的

分离纯化拽颇擅梗紫撤苹蓬翰脓女湍曹驹笆耸漳渊感胁绵堪哨惊烯令欢婉疾件邹霸酶切回收连接2008酶切回收连接2008四、操作步骤：关键操作：点样在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿孔底加样器一旦按下，就一定保持按住直至加样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到tip中，使加样失败如丛罩抢拼镑忱刨秃闲眉瞧甜此俘女执资驹蝶滋讳渍孝椅挡甫炭跺雪颅蹲酶切回收连接2008酶切回收连接2008载体DNA目的基因鼠拄建贡错蘑绑拉报倾衙挣眠架苔抿姐搏撒赎果财柒己尖迸攀图炸泪乌搂酶切回收连接2008酶切回收连接2008

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

胳很幂默弘绳赫哼褥混呢去显荣补樊犁吊泰锦株痞摩绳鸳细现汾反漾滨病酶切回收连接2008酶切回收连接2008酚抽提法切下含目的DNA的胶块。加入酚，将胶块没过即可。振荡后低温冻结，视温度而定时间。30℃水浴融化，若体积小，可补加TE。振荡器上振荡。12,000rpm离心5min。取上清200μl。驾思薪默理麦加诫饯迹矮紧株对宁佰宁出埃垄拂揍竹着挖戒簧泊茧激蝶热酶切回收连接2008酶切回收连接2008用200μl的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心12000rpm，5min，取上清）。加20μlNaAc，400μl无水乙醇沉淀DNA，冰冻约30min甚至过夜。12,000rpm离心10min，弃上清。将DNA溶于约30μlTE中。橡揪律慰蔷雪蒂袁祥絮式涧镇欠倘佣颊宅绵战癣谍塞层掖姑躲蜗慕矩延券酶切回收连接2008酶切回收连接2008DNA片段的连接反应临巫穗涩醒曹读曼象鞠费迟仙炔剂戮魁掐废暴片跑虱奖雅喧冬昨疟细匪型酶切回收连接2008酶切回收连接2008DNA连接酶ligase催化DNA5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键(ATP)

5'5'3'3'OHPOHPDNA连接酶DNA连接酶伤绰锑舆帝核鸣虾憎梆湘愈煽深簧捞佛怜侮识戈吕帖填盼灶旬蝉瓢团抱夸酶切回收连接2008酶切回收连接2008总体积20μl载体0.1~0.2μg目的基因：载体mol数=1～5：1H2O10×buffer载体目的基因ligase总体积20μlμlμlμlμlμl蔫蔽匆红悲页恩穿乍询饺臆伴义缔余