工业发酵培养基

关于工业发酵培养基知识目标

1、了解工业发酵培养基原料转换的意义

2、了解工业发酵培养基配方设计的一般思路

3、理解影响工业发酵培养基质量的因素

4、掌握工业发酵培养基的主要成分及其作用

5、掌握工业发酵培养基的主要类型及其特征能力目标

1、能正确选择工业发酵培养基的原料

2、能配制适合不同发酵阶段需要的培养基

第2页,共62页，2024年2月25日，星期天培养基（Medium）

：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。是人工配制的供微生物、植物和动物细胞生长、繁殖和合成人们所需要产物的营养物质和原料，同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它生长所必须的环境条件。发酵培养基的作用：

满足菌体的生长促进产物的形成概述第3页,共62页，2024年2月25日，星期天第一节工业发酵培养基的成分

工业发酵培养基与实验室培养基的成分基本相同，一般都含有碳源、氮源、无机盐（包括微量元素）以及生长因子和水等。此外，为了合成特殊产物或工艺控制要求，有的发酵培养基还需加入前体、抑制剂、促进剂或消沫剂等。第4页,共62页，2024年2月25日，星期天一、碳源：凡是能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质叫做碳源。包含速效碳，缓效碳。

1.糖类：

2.油脂：

3.有机酸、醇、碳氢化合物第5页,共62页，2024年2月25日，星期天李江华，无锡轻工大学学报，2004(半纤维素酶)(1.5g麸皮)第6页,共62页，2024年2月25日，星期天嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型苏勤，林业化学与工业，2004第7页,共62页，2024年2月25日，星期天1、糖类①单糖：葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖但是会引起葡萄糖效应：菌体呼吸快、溶解氧不足，导致中间代谢产物积累，pH下降，抑制生长和产物形成。②

双糖：蔗糖、乳糖、麦芽糖糖蜜第8页,共62页，2024年2月25日，星期天糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜

糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。第9页,共62页，2024年2月25日，星期天第10页,共62页，2024年2月25日，星期天不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响第11页,共62页，2024年2月25日，星期天糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐第12页,共62页，2024年2月25日，星期天③多糖：淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等难利用、发酵液比较稠、一般加入一定的α-淀粉酶。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应第13页,共62页，2024年2月25日，星期天2.油脂：霉菌和放线菌可以利用油脂作为碳源，有消沫和补充碳源双重作用，但必需提供充足氧气，否则有机酸积累，pH下降，同时储存过程酸败作用产生毒副作用。3.有机酸、醇、碳氢化合物：某些有机酸、醇在单细胞蛋白、氨基酸、维生素生产中作为碳源使用，而石油产品作为微生物发酵的主要原料也在深入研究和推广之中。第14页,共62页，2024年2月25日，星期天二、氮源

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。包含速效氮，缓效氮，常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。

1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之为速效氮，有利于微生物生长。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH第15页,共62页，2024年2月25日，星期天

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH第16页,共62页，2024年2月25日，星期天无机氮源的影响：硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素第17页,共62页，2024年2月25日，星期天2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等第18页,共62页，2024年2月25日，星期天

有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响第19页,共62页，2024年2月25日，星期天氮源使用的一些相关问题：

有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质

有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：蛋白酶的生产

有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力

开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题第20页,共62页，2024年2月25日，星期天三、无机盐及微量元素1、作用：各种不一样2、来源：C、N源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点

对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑第21页,共62页，2024年2月25日，星期天例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响

pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟第22页,共62页，2024年2月25日，星期天四、生长因子、前体和产物促进剂

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

1、生长因子

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。

有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子第23页,共62页，2024年2月25日，星期天

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。2、前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第24页,共62页，2024年2月25日，星期天作用：前体有助于提高产量和组份用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%第25页,共62页，2024年2月25日，星期天用法：前体使用时普遍采用流加的方法

前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%

前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率第26页,共62页，2024年2月25日，星期天3、产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。第27页,共62页，2024年2月25日，星期天

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。第28页,共62页，2024年2月25日，星期天五、水

对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。

水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。第29页,共62页，2024年2月25日，星期天六、消沫剂消沫剂又称泡敌、消泡剂，是一种化学合成制品。属“非离子表面活剂”的一种，产品为无色或淡黄色粘稠液体。用途：

可广泛用于医药工业抗生素生产，味精食品的生产以及其他发酵工业，有效强的消泡效果。它的消泡率比食用豆油的消泡率高达几十倍。也可供油田打井时泥浆材料的消泡。（食用豆油：常用于食品类发酵食品的消泡）第30页,共62页，2024年2月25日，星期天消沫剂-聚醚消沫剂G·P·E

1、活性成份:聚氧丙烯聚氧乙烯有规二醇或三醇醚。2、物理特性:外观:浅黄色至无色透明粘稠液体，羟值:45-56mgKOH/g，浊点:17-22℃(1%水溶液)，酸值:≤0.5mgKOH/g，分子量:3000-3800。3、产品简介:本品主要针对发酵工业消泡而设计，根据实践使用作了多次重要改进，是一支特别成熟、竞争力很强的产品，比一般的聚醚型消沫剂要节药10-20%使用量，主要应用于土霉素、青毒素、四环素、链霉素、洁霉素、红霉素、利福平、阿维菌素、赖氨酸、酵母等发酵过程中消泡。也可以应用于合成纤维油剂、乳化剂、低泡清洗剂等行业。4、使用方法:在制药发酵中使用，可以与基础料一起配入，也可分消进罐，一般使用量在0.3-0.5‰左右。5、包装贮运:本品采用200kg镀锌铁桶包装。常温下贮存期一年内有效。

第31页,共62页，2024年2月25日，星期天第二节工业发酵培养基的类型和配方设计

目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

第32页,共62页，2024年2月25日，星期天一、培养基的类型一、按纯度分合成培养基：是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。半合成培养基：既有天然有机物，又有化学试剂配制的培养基。

天然培养基：利用动、植物或微生物包括其提取物制成的培养基。如：麦芽汁培养基。第33页,共62页，2024年2月25日，星期天2、按状态固体培养基

:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产

半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8%,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。第34页,共62页，2024年2月25日，星期天3、按用途（从发酵生产应用考虑）孢子（斜面）培养基：活化菌种、制备孢子用（斜面培养基）种子培养基：供孢子发芽和菌体繁殖用，其质量对发酵水平影响很大。发酵培养基：供菌体生长繁殖和和合成大量代谢产物用，要求培养基的组成丰富完整。

第35页,共62页，2024年2月25日，星期天二、培养基的设计

培养基成分的含量最终都是通过实验获得的

合理的实验方法多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。多因子实验第36页,共62页，2024年2月25日，星期天3）采用多因子实验，包含均匀设计、正交实验设计、响应面分析等方法在摇瓶水平优化培养基的配方。4）小试、中试发酵罐规模进一步优化配方；5）规模化生产（工业生产）优化培养基配方。培养基设计的思路1）根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；2）通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；第37页,共62页，2024年2月25日，星期天类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健第38页,共62页，2024年2月25日，星期天原培养基:第39页,共62页，2024年2月25日，星期天

初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)第40页,共62页，2024年2月25日，星期天

通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好第41页,共62页，2024年2月25日，星期天结果：碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%

酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.05%第42页,共62页，2024年2月25日，星期天

正交设计确定优化的配方第43页,共62页，2024年2月25日，星期天第44页,共62页，2024年2月25日，星期天改进后培养基原培养基改进培养基后的发酵结果第45页,共62页，2024年2月25日，星期天

摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培养基研究的两个层次

摇瓶——培养基设计的第一步

反应器—最终的优化的基础配方第46页,共62页，2024年2月25日，星期天例：青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大第47页,共62页，2024年2月25日，星期天摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础第48页,共62页，2024年2月25日，星期天发酵罐：反应器水平,可以得出最终优化的基础配方第49页,共62页，2024年2月25日，星期天pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究第50页,共62页，2024年2月25日，星期天考虑培养基总体要求时应注意的问题1、营养丰富、有产物合成的潜力。2、各原材料之间不反应，理化性质相对稳定。3、粘度适中，具有适当的渗透压。4、利于产物的合成并能维持较长时间的最高生产速率。5、生产过程不影响通气与搅拌，又不影响产物的精制和废物处理。第51页,共62页，2024年2月25日，星期天6、原材料的选择要因地制宜，质优价廉。成本低，来源充足。7、要考虑速效与迟效碳、氮源的相互配合。8、选用适当的碳氮比9、注意生理酸碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。10、培养基成分量的确定大部分根据经验而定，有些可以根据物料平衡计算加以确定。第52页,共62页，2024年2月25日，星期天

第三节影响培养基质量的因素

水质的影响

原材料的质量

灭菌的影响

在工业发酵过程中，常出现生产水平大幅度波动或菌体代谢异常现象，产生这种现象的主要原因是种子质量不稳定、发酵工艺控制不严等，其中培养基质量也是一个重要因素。引起培养基质变的因素主要有：第53页,共62页，2024年2月25日，星期天一、原材料的影响有机氮源的原材料质量是引起生产水平波动的主要因素之一。（原材料品种、产地、加工方法、贮存条件等）碳源影响不如氮源显著，但也能较大幅度引起发酵水平波动。无机盐和前体等化学物质组成明确，有一定的质量规格，较易控制。第54页,共62页，2024年2月25日，星期天原材料选择原则原材料的质量对培养基的质量直接产生影响，因此在工业生产中，为了稳定生产水平和提高产量和质量，对所采用的全部原材料的质量要严格控制，按质量标准严格检测，如果要改换原材料的品种时，必需先进行小试、甚至中试，确信对生产没有影响时，才能用于实际生产，对不符合质量标准和生产工艺要求的原材料不能随意用于生产。第55页,共62页，2024年2月25日，星期天二、水质的影响水是构成培养基的主要原材料之一，水的质量对许多产品直接产生影响。大生产中常使用的水有深井水、自来水、地表水和纯净水。不同来源的水的质量与环境条件有关。生产中对水的质量要定期检测，地表水要适当处理方能使用。第56页,共62页，2024年2月25日，星期天三、灭菌的影响

在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件