下酶的抑制动力学

关于下酶的抑制动力学第二章酶催化的基础知识

第三节酶的抑制动力学及应用第2页,共108页，2024年2月25日，星期天第3页,共108页，2024年2月25日，星期天去激活作用：

如EDTA去除二阶金属离子，以降低酶的活性。

此作用并非是化学物质对酶蛋白或其辅因子的直接作用。第4页,共108页，2024年2月25日，星期天食品加工过程中由于多酚氧化酶的作用，发生酶促褐变，使果蔬类加工食品货架寿期缩短。多酚氧化酶是含铜金属蛋白，因而许多金属螯合剂是其抑制剂。第5页,共108页，2024年2月25日，星期天第6页,共108页，2024年2月25日，星期天一、可逆抑制按抑制剂与酶的结合方式：

同位抑制作用：抑制剂与酶活性中心结合，阻断酶分子的结合基团或催化基团，或者与ES复合物相结合，阻止底物形成产物。别位抑制作用：抑制剂与酶活性中心以外的部位结合，通过酶分子构象的改变影响底物与酶的结合，进而影响催化效率。第7页,共108页，2024年2月25日，星期天研究酶抑制剂及其抑制作用的意义：

理论上：阐明酶活性中心、酶催化机理、代谢途径、代谢调节、药物和毒物作用机理。应用上：（1）药物：抑制病原微生物；治疗代谢疾病；保健、美容等功效。（2）农业中的杀虫剂和杀菌剂。（3）食品加工过程中有害酶的活性抑制剂。第8页,共108页，2024年2月25日，星期天（一）竞争性抑制作用的含义第9页,共108页，2024年2月25日，星期天第10页,共108页，2024年2月25日，星期天(1)竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。米氏常数变大竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。第11页,共108页，2024年2月25日，星期天竞争性抑制动力学曲线第12页,共108页，2024年2月25日，星期天第13页,共108页，2024年2月25日，星期天

竞争性抑制的动力学经推导可得如下曲线1、Km增大即抑制剂与酶结合后，酶和底物亲和力降低；

I

越高、Ki越小，Km增大。酶和底物亲和力降低，酶反应速度减慢。2、Vm不变3、增大底物浓度，有利于酶和底物结合，可减轻抑制作用；反之，增加抑制剂浓度，加深抑制程度。第14页,共108页，2024年2月25日，星期天2.竞争性抑制作用的机理（1）抑制剂与底物在结构上有类似之处（2）可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而阻断了底物和酶的结合（3）降低酶和底物的亲和力。第15页,共108页，2024年2月25日，星期天3.竞争性抑制作用举例第16页,共108页，2024年2月25日，星期天丙二酸是琥珀酸的结构类似物，可逆抑制琥珀酸脱氢酶活性乙醇作为竞争性底物可以抑制乙二醇氧化成乙醛的反应，（因此乙醇可以用于治疗乙二醇中毒）第17页,共108页，2024年2月25日，星期天抑菌剂二氢叶酸合成酶转肽基酶第18页,共108页，2024年2月25日，星期天第19页,共108页，2024年2月25日，星期天第20页,共108页，2024年2月25日，星期天两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽酶，导致胞壁合成障碍。第21页,共108页，2024年2月25日，星期天

酶抑制剂：是一类可以结合酶并降低其活性的分子。由于抑制特定酶的活性可以杀死病原体或校正新陈代谢的不平衡，许多相关药物就是酶抑制剂。一些酶抑制剂还被用作除草剂或农药第22页,共108页，2024年2月25日，星期天

20世纪60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念,从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。酶抑制剂新药发现的途径：一是来源于天然化合物，包括动植物和各种微生物等，二是化学合成物。在目前上市的药物中，以受体为作用靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。因此，酶抑制剂的开发是新药来源的一个主要途径。以酶为靶点开发新药存在巨大潜力，今后很长一段时间仍然是发现新药的重要着手点。第23页,共108页，2024年2月25日，星期天H7N9新药(帕拉米韦)

强效神经氨酸酶抑制剂第24页,共108页，2024年2月25日，星期天第25页,共108页，2024年2月25日，星期天整合酶抑制剂的发现和发展第26页,共108页，2024年2月25日，星期天4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂

所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复合体后被活化的过渡形式，一般用S*表示，由于其能障小，和酶结合就紧密得多。第27页,共108页，2024年2月25日，星期天4过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂第28页,共108页，2024年2月25日，星期天（二）反竞争性抑制第29页,共108页，2024年2月25日，星期天第30页,共108页，2024年2月25日，星期天反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）

对酶活性的一种抑制作用，由于所加入的抑制剂能与酶-底物复合物结合，而不与游离酶结合，所以其特征是反应的最大速度比未加抑制剂时反应的最大速度低，当以速度的倒数相对底物浓度的倒数作图，所得图线与未被抑制反应的图线平行。第31页,共108页，2024年2月25日，星期天反竞争抑制作用

加入I时，反而可增加S对E的亲和力，而增加S并不能减轻或消除抑制；有I时，Km减小，说明I可使E对S的亲和力增大。第32页,共108页，2024年2月25日，星期天

反竞争性抑制动力学曲线第33页,共108页，2024年2月25日，星期天第34页,共108页，2024年2月25日，星期天2.反竞争性抑制举例单底物酶：芳香基硫酸基的肼解氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用多底物：如双底物乒乓机制中，任何一个底物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性抑制剂。第35页,共108页，2024年2月25日，星期天（三）非竞争性抑制第36页,共108页，2024年2月25日，星期天第37页,共108页，2024年2月25日，星期天非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）

抑制剂在酶的活性部位以外的部位与酶结合，不对底物与酶的活性产生竞争。

作用：抑制剂不仅与游离酶结合，也可以与酶-底物复合物结合的一种酶促反应抑制作用。酶-底物-抑制剂复合物（ESI）不能进一步释放出产物。第38页,共108页，2024年2月25日，星期天非竞争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。第39页,共108页，2024年2月25日，星期天特点：⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；⑷动力学参数：Km值不变，Vm值降低。第40页,共108页，2024年2月25日，星期天第41页,共108页，2024年2月25日，星期天第42页,共108页，2024年2月25日，星期天非竞争性抑制的动力学可推导得出如下的曲线1、Vm降低即

I

越大、Ki越小，形成不能转变为产物的EI和EIS越多，V降低的程度越显著。2、Km不变3、增大底物浓度，不能减轻抑制作用，无竞争关系；第43页,共108页，2024年2月25日，星期天2.非竞争性抑制举例第44页,共108页，2024年2月25日，星期天（四）混合型抑制作用

是非竞争性与其他两种类型的混合，竞争性与反竞争性抑制二者之间不存在混合型。第45页,共108页，2024年2月25日，星期天第46页,共108页，2024年2月25日，星期天（五）其他可逆抑制1．底物抑制2．产物抑制第47页,共108页，2024年2月25日，星期天第48页,共108页，2024年2月25日，星期天第49页,共108页，2024年2月25日，星期天2．产物抑制产物对酶反应的抑制作用在生物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时存在的，因此，考虑产物对反应速度的影响，可能具有一定的意义。第50页,共108页，2024年2月25日，星期天二、不可逆抑制作用不可逆抑制作用：如果[E]>[I],则I只能使部分的酶失活，余下的酶仍是正常的，可以行使正常的催化功能。米氏常数不变，而Vmax下降，得到的双倒数图和可逆抑制中的非竞争性抑制非常相似。

非专一性：专一性第51页,共108页，2024年2月25日，星期天（一）非专一性的不可逆抑制作用1．概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。2类型：重金属、酰化剂、烃基化剂、含活泼双键的试剂、有机磷化合物、烷化剂、还原剂第52页,共108页，2024年2月25日，星期天农药杀虫的机理-抑制生物体中的靶酶。

乙酰胆碱酯酶（ACHE）：催化乙酰胆碱，水解为胆碱和乙酸例如：有机磷的杀虫原理主要是：有机磷对生物体神经突触后膜上的乙酰胆碱酯酶（ACHE）的抑制，造成突触间隙乙酰胆碱的积蓄，持续地作用于受体，引起一系列反应使病虫神经过度兴奋而死亡第53页,共108页，2024年2月25日，星期天（二）专一性不可逆抑制剂概念：抑制剂通常只作用于酶蛋白分子中一种氨基酸侧链基团或仅作用于一类酶。专一性不可逆抑制剂的类型:1．Ks型结合型不可逆抑制剂

2．Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀底物）第54页,共108页，2024年2月25日，星期天1、Ks型结合型专一性不可逆抑制剂抑制剂只能专一地与某种酶结合而引起的不可逆抑制作用根据底物的化学结构设计，可以和酶结合，并对酶的必需基团进行化学修饰，从而抑制酶的活性。是利用对酶的亲和力而对酶进行修饰标记，所以又称亲和标记试剂。举例：

1对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶

2对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶第55页,共108页，2024年2月25日，星期天2．Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀底物）

抑制剂能专一地与某种酶结合并发生催化反应，而反应的产物中含有一个基团可以与酶分子活性中心的基团共价结合，导致酶分子不可逆地丧失催化活性。第56页,共108页，2024年2月25日，星期天Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）（1）天然酶的自杀底物（2）治疗用人工合成的酶自杀底物第57页,共108页，2024年2月25日，星期天（2）治疗用人工合成的酶自杀底物治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀底物疗法。第58页,共108页，2024年2月25日，星期天例：以FMN或FAD为辅酶的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂迫降灵第59页,共108页，2024年2月25日，星期天第60页,共108页，2024年2月25日，星期天第61页,共108页，2024年2月25日，星期天酶抑制剂的抑制程度：

在抑制剂存在下，酶反应速度下降的成都，常用有抑制作用的反应速度（vi）与无抑制作用的反应速度（v）。

a：相对活力分数

i：抑制分数i＝1－a第62页,共108页，2024年2月25日，星期天第四节酶的调节

酶活性的调节酶浓度的调节第63页,共108页，2024年2月25日，星期天酶活性调节的实例：

凝血酶、胰蛋白酶激活

糖元磷酸化酶活性转化

母体分娩后母乳中乳糖合成

丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶活性

苏氨酸到异亮氨酸的代谢途径控制第64页,共108页，2024年2月25日，星期天

说明了——正常情况下生物体并不要求每个酶处于最有效的催化状态，而是要求有快有慢。在长期的进化、选择过程中，生物体为适应外界环境变化，满足生理功能的需要，形成了一整套调节机制。（酶合成水平上的调节和酶结构活性水平上的调节)第65页,共108页，2024年2月25日，星期天

多种调节方式：

浓度调节（合成降解调节)；

生理调节(激素调节)；

共价修饰调节（可逆，不可逆)；抑制剂调节；

反馈调节（别构调节）；

存在方式调节（多酶体系）；

寡聚酶的聚合、解聚调节；

第66页,共108页，2024年2月25日，星期天

1.调节酶在细胞内的浓度

如：大肠杆菌的葡萄糖效应，即在有葡萄糖存在时，它不利用乳糖。原理可以用乳糖操纵子模型来解释。

腺苷酸环化酶

AMPcAMP+H2O

磷酸二脂酶第67页,共108页，2024年2月25日，星期天乳糖操纵子模型第68页,共108页，2024年2月25日，星期天

2.

生理调节或激素调节在特殊生理条件下，分泌某一种激素来调节酶的活性。如：乳腺组织中的乳糖合成酶。

乳糖合成酶是蛋白A和蛋白B两组分构成的复合物，可以催化乳糖合成反应：

EUDP-半乳糖+葡萄糖乳糖+UDP第69页,共108页，2024年2月25日，星期天

蛋白A不能催化上述反应而能催化下述合成反应：UDP-半乳糖+N-乙酰葡糖胺N-乙酰半乳糖胺+UDP

蛋白B本身无催化能力，但其与蛋白A结合，可以改变蛋白A的底物专一性。A第70页,共108页，2024年2月25日，星期天

3、共价修饰调节

不可逆共价调节——酶原激活

◆一些酶（主要是消化酶和执行防御功能的酶）在细胞内以无活性前体形式（即酶原）合成和分泌，然后输送到胞内外作用部位去，当功能需要时就会被活化而起作用。可以想象，必须有一种调控机制，使其在胞内合成时处于失活状态，而在需要时激活；◆在酶原激活过程中，酶原分子结构发生了这样的变化：

首先，酶原分子被切去若干小段，即发生一级结构变化、

一级结构变化引起酶分子活性部位构象变化，形成能与特异性底物相结合的完整的疏水口袋。第71页,共108页，2024年2月25日，星期天胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶Ser14—Arg15Thr147—Asn148A链B链C链胰凝乳蛋白酶原（无活性）π--胰凝乳蛋白酶（有活性）α--胰凝乳蛋白酶（有活性,稳定）α--胰凝乳蛋白酶（三链间有二硫键）◆α--胰凝乳蛋白酶为稳定的形式，A、B两链及B、C两链间各通过一对大的二硫键相连，其活性只有π--胰凝乳蛋白酶的2/5◆

酶活性中心的氨基酸残基来自B、C二链第72页,共108页，2024年2月25日，星期天胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶羧肽酶原羧肽酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶对各个胰脏蛋白酶原的激活作用第73页,共108页，2024年2月25日，星期天

综上所述，酶原激活有两个特点：是蛋白质肽链的水解过程，不可逆激活后，不能变为酶原状态，因而这是“一次性”的调节，能及时地从靶部位通过自身催化或组织蛋白酶的作用而降解移去都是通过级联系统实现的快速的信号放大过程，以完成特定功能第74页,共108页，2024年2月25日，星期天

可逆的共价调节

由于其他的酶对其结构进行共价修饰，而使其在活性形式与非活性形式之间进行互变.第一种类型是磷酸化酶及其他的一些酶，它们通过接受ATP转来的磷酸基的共价修饰，或脱下磷酸基，来调节酶活性：酶的无活性形式酶的有活性形式最典型的例子是动物组织中的糖原磷酸化酶：（葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸-葡萄糖E第75页,共108页，2024年2月25日，星期天糖原磷酸化酶的活性形式及非活性形式间的平衡，是磷酸基共价地结合到酶上或从酶上脱下，从而控制调节磷酸化酶的活性糖原磷酸化酶及其他受共价修饰调节的调节酶可以将化学信号极大的放大。如一分子磷酸化酶的激酶可以催化几千个无活性的磷酸化酶b分子变为有活性的磷酸化酶a，从而催化糖原形成几千个分子的1-磷酸葡萄糖，这就形成了具有两步的级联放大（amplificationcascade）实际上这两个酶是肾上腺素激素分子化学信号造成组织中糖原急剧分解的一个更长的级联放大中的一部分.见图+4H2O4ADP4Pi4ATPPPPP磷酸化酶激酶磷酸化酶磷酸酶磷酸化酶a（有活性）磷酸化酶b（无活性）第76页,共108页，2024年2月25日，星期天第77页,共108页，2024年2月25日，星期天第二种类型是大肠杆菌谷氨酰胺合成酶及其他一些酶，它们受ATP转来的酰苷酰基的共价修饰，或酶促脱酰苷酰基，而调节酶活性：酶的活性较高形式酶的活性较低形式谷氨酰胺合成酶催化下列反应：ATP+谷氨酸+NH3ADP+谷氨酰胺+Pi

它有12个亚基，酰苷酰基从ATP脱下后连接到每一个亚基的专一性酪氨酸残基上，产生低活性形式的酪氨酸酚羟基的酰苷酰衍生物第78页,共108页，2024年2月25日，星期天

4.抑制剂的调节第79页,共108页，2024年2月25日，星期天

5.反馈调节(或称别构调节)

早已发现，许多物质合成代谢途径的一连串反应中，催化第一步反应的酶或者是序列交叉处的酶大多能被全部序列的最终产物控制——反馈抑制。催化第一部反应的酶或分叉处的酶即属于别构酶。第80页,共108页，2024年2月25日，星期天

什么是别构调节？

当调节物与酶分子中的别构中心结合后诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性部位对底物的结合与催化受到影响，从而调节酶的反应速度及代谢过程，此效应称为酶的别构调节或别构效应。

第81页,共108页，2024年2月25日，星期天是通过酶分子构象的变化来改变的活性，又称就变构酶具有两个在空间上彼此独立并分开的特异部位：活性部位、调节部位效应物同调节部位结合→酶构象改变→活性改变。第82页,共108页，2024年2月25日，星期天第83页,共108页，2024年2月25日，星期天第84页,共108页，2024年2月25日，星期天特性：1．均寡聚酶2．一般位于代谢途经的第一步反应，也称限速反应。3．效应物（别构剂）一般都是小分子，与别构酶的结合是特异的4．别构酶促反应不遵循米氏方程5．从动力特征看，正协同别构酶呈S形曲线6．别构酶具协同效应

协同效应指一个分子与酶结合后对第二个分子结合的影响。第85页,共108页，2024年2月25日，星期天

第一个酶（有活性）第一个酶（无活性）终产物终产物（调节物）结合在调节中心第86页,共108页，2024年2月25日，星期天反馈抑制的类型第87页,共108页，2024年2月25日，星期天

已知别构酶的结构特点：

▲有多个亚基、有四级结构；▲除了有可以结合底物的酶的活性中心之外，还有可以结合调节物的别构中心，而且，这两个中心位于酶蛋白的不同部位上,或处在不同的亚基上（如ATCase），或处在同一个亚基的不同部位上。第88页,共108页，2024年2月25日，星期天别构酶调节酶活性的机理

续变模型也称KNF模型

▲这种假说主张酶分子中的亚基结合小分子物质（底物或调节物）后，亚基构象逐个地依次变化，因此亚基有各种可能的构象状态。

SSSSSSSSSSSSSS亚基全部处于“关”型亚基全部处于“开”型

按次序变化第89页,共108页，2024年2月25日，星期天

齐变模型或对称模型

T状态R状态

主张所有别构酶的所有亚基，或者全部成不利于结合底物的T状态，或者全部是有利于结合底物的R状态，这两种状态间的转变对于每个亚基都是同时的、齐步发生的。第90页,共108页，2024年2月25日，星期天别构调节动力学大部分变构酶的初速度-底物浓度的关系不符合典型的米氏方程，即不是简单的双曲线，而是呈S型的v-[S]曲线。第91页,共108页，2024年2月25日，星期天这种S型的反应体现为当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度的控制着反应速度，这就是别构酶可以灵敏地调节酶反应速度的原因所在，即正协同效应使得酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感另有一类具有负协同效应的酶，在这种曲线中，在底物浓度较低的范围内酶活力上升很快，但继续下去，底物浓度虽有较大提高，但反应速度升高却较小，也就是说负协同效应可以使酶的反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感第92页,共108页，2024年2月25日，星期天正负协同效应的区别正协同效应负协同效应第93页,共108页，2024年2月25日，星期天Koshland等人建议，用以下比例式定量的判断与区分三类酶：

Rs=——————————————————————————

▲

典型的米氏类型的酶Rs=81

▲

具有正协同效应的别构酶Rs<81

▲

具有负协同效应的别构酶Rs>81酶与底物（或配基）结合达90%饱和度时的底物（或配基）浓度酶与底物（或配基）结合达10%饱和度时的底物（或配基）浓度第94页,共108页，2024年2月25日，星期天别构酶举例大肠杆菌的天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase（aspartatetranscarbamoylase）——它是嘧啶核苷酸生物合成CTP-多酶体系反应序列中的第一个酶其正常底物为天冬氨酸及氨甲酰磷酸它受CTP的反馈抑制，CTP是其负调节物，其正调节物是ATP它所催化的反应如下：氨甲酰磷酸+天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸

UMPUTPCTP

第95页,共108页，2024年2月25日，星期天第96页,共108页，2024年2月25日，星期天

CTP在不影响酶的Vmax的情况下通过降低酶与底物的亲和性来抑制ATCase；ATP则相反，它增强酶与底物的亲和性，也不影响其Vmax。这种调节的生物学意义是：

ATP作为信号表明有能量供DNA复制使用并引发需求嘧啶核苷酸的生物合成；CTP则保证在嘧啶核苷酸已丰足时，不再进行不必要的氨甲酰天冬氨酸及其他后续中间物的合成。

ATCase由C、R亚基组成：C亚基可与底物作用，有活性中心，但活性中心对调节分子CTP及ATP没有反应；R亚基上有可以结合CTP及ATP的别构中心，但无催化活性。

第97页,共108页，2024年2月25日，星期天ATCase的三维结构汞化物巯基乙