分子发光荧光磷光及化学发光

1关于分子发光荧光磷光及化学发光23.光分析方法光分析法原子吸收法红外法原子发射法核磁法荧光磷光化学发光紫外可见法分子光谱原子光谱第2页,共105页，2024年2月25日，星期天3第六章分子发光—荧光、磷光及化学发光ChapterSixFluorescencePhosphorescenceandChemiluminescence第3页,共105页，2024年2月25日，星期天4分子发光—荧光、磷光及化学发光

FluorescencePhosphorescenceandchemiluminescence6.1分子发光的基本原理6.2分子荧光和磷光的影响因素6.3荧光（磷光）分光光度计6.４荧光分析法的应用6.５化学发光分析法第4页,共105页，2024年2月25日，星期天5第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。6.1分子发光的基本原理第5页,共105页，2024年2月25日，星期天

分子光谱的产生1．分子的能级Ｓ2Ｓ1Ｓ0υ0υ1υ2υ,0υ,1υ,21J023J0231J0231J0231分子紫外吸收光谱分子可见吸收光谱分子红外吸收光谱分子光谱：连续光谱带光谱远红外光谱中红外光谱紫外-可见光谱第6页,共105页，2024年2月25日，星期天分子的活化与去活化S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫２.无辐射跃迁的类型振动弛豫:Vr10-12sec外转移:无辐射跃迁回到基态内转移:S2~S1能级之间有重叠系间窜跃:

S2~T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后T1~

S2１.辐射跃迁的类型共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：10~10-4sec迟滞荧光:102~10-4sec第7页,共105页，2024年2月25日，星期天8２.单重态与三重态受激有机分子的电子激发态可以归纳为两种状态：基态激发态单重态激发态三重态激发态平均寿命

10-8sec激发态平均寿命10-4~1secS0S0S0S1T1第8页,共105页，2024年2月25日，星期天第9页,共105页，2024年2月25日，星期天分子的活化与去活化S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫２.无辐射跃迁的类型振动弛豫:Vr10-12sec外转移:无辐射跃迁回到基态内转移:S2~S1能级之间有重叠系间窜跃:

S2~T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后T1~

S2１.辐射跃迁的类型共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光:102~10-4sec第10页,共105页，2024年2月25日，星期天11３．振动弛豫

当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层跃迁到激发态的较高的振动能层上去．然而，在液相或压力足够高的气相中分子间碰撞的几率很大，激发态分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围的分子，而自身从高振动能层失活到该电子能级的最低振动能层上，这一过程称为振动弛豫．发生振动弛豫的时间为10-12s数量级．第11页,共105页，2024年2月25日，星期天12４．内转换

内转换指的是相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程．当两个电子能级的振动能层间有重叠时，则可能发生电子由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子的激发态．内转换过程在10-13~10-11s时间内发生，它通常要比由高激发态直接发射光子的速度快得多．第12页,共105页，2024年2月25日，星期天13５．外转换

激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程称外转换．这一现象称为“熄灭”或“猝灭”．自较低的激发单重态及较低的三重态的非辐射跃迁可包含外转换，也可包含内转换．第13页,共105页，2024年2月25日，星期天14６．系间跨跃系间跨越指的是不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程．它涉及受激电子自旋状态的改变．如S1到T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对．这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子能态的振动能层有较大的重叠时，如图中激发单重态S1的最低振动能层与激发三重态T1的较高振动能层重叠，则可能通过自旋－轨道耦合等作用使S1态转入T1态的某一振动能层．第14页,共105页，2024年2月25日，星期天15７．荧光、磷光发射从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在10-4~10s左右时间内跃迁回基态而发生磷光．由此可见，荧光与磷光的根本区别是：荧光是由第一电子激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由第一电子激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的．第15页,共105页，2024年2月25日，星期天第16页,共105页，2024年2月25日，星期天第17页,共105页，2024年2月25日，星期天181.分子荧光与磷光的产生（1）单重态与三重态（2）分子的活化与去活化（3）分子发光的类型按激发的模式分类：按分子激发态的类型分类：光致发光化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光

分子发光分子发光荧光磷光瞬时荧光迟滞荧光按光子能量分类：斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem共振荧光(Resonance)：λex=λem

荧光

第18页,共105页，2024年2月25日，星期天192.分子荧光(磷光)光谱(1)荧光(磷光)激发光谱与发射光谱荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。a.激发光谱固定

em=620nm(Max)

ex=290nm(Max)固定发射波长扫描激发波长荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似第19页,共105页，2024年2月25日，星期天

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(Max)固定

ex=290nm(Max)

em=620nm(MAX)b.发射光谱(荧光光谱)固定激发波长扫描发射波长c.激发光谱与发射光谱的镜像关系S04321S14321发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1→

41→

31→21→11→11→

21→

31→

4第20页,共105页，2024年2月25日，星期天d.磷光光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱发射光谱第21页,共105页，2024年2月25日，星期天22第22页,共105页，2024年2月25日，星期天23第23页,共105页，2024年2月25日，星期天24（2）三维荧光光谱IF

∝f(λex

、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长第24页,共105页，2024年2月25日，星期天25IF

∝f(λex

、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长第25页,共105页，2024年2月25日，星期天26蒽的三维等高线光谱图第26页,共105页，2024年2月25日，星期天27蒽的三维等荧光强度光谱第27页,共105页，2024年2月25日，星期天VB1和VB2的三维荧光光谱第28页,共105页，2024年2月25日，星期天RLSDSTSATSADS散射片三维共振光散射光谱（3）三维共振光散射光谱ADSATSTSRLSDS散射片三维共振光散射等高线光谱图共振光散射瑞利散射固定

ex=270nm拉曼光二级共振光散射三级共振光散射荧光光谱有用区间第29页,共105页，2024年2月25日，星期天3.分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系（1）荧光强度(磷光)与浓度的关系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：第30页,共105页，2024年2月25日，星期天对于稀溶液，当

bc<0.05（磷光

bc<0.01）时：IF----荧光强度

F-----荧光量子产率k--与仪器灵敏度有关的参数I0--入射光强度IP----磷光强度

P-----磷光量子产率b--吸收光程

--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度（2）荧光(磷光)的平均寿命

分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来的1/e所经历的时间。对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均寿命()可以右式表示：kF

荧光发射过程的速率常数ki

非辐射跃迁速率常数

第31页,共105页，2024年2月25日，星期天（3）荧光(磷光)的量子产率荧光量子产率的定义：kF、kp主要取决与荧光物质的分子结构；

st系间窜跃效率。

ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，

F=0.55；

荧光素

F=1化合物

F0.10.290.460.600.52第32页,共105页，2024年2月25日，星期天（1）跃迁的类型２．荧光与有机化合物的结构对于有机荧光物质:提供π轨道，有不饱和官能团π*

→π

π*→nn→π*εmax＜

100平均寿命10-5~10-7secπ→π*

εmax≥104平均寿命10-7~10-9seckS→T小π*→π

是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。强荧光的有机化合物具备下特征:ａ．具有大的共轭π键结构（孤立双键不呈现显著荧光）ｂ．具有刚性的平面结构ｃ．具有最低的单重电子激发态S1，跃迁为π*

→π型ｄ．取代基团为给电子取代基6.２分子荧光与磷光强度的影响因素１．荧光的量子产率第33页,共105页，2024年2月25日，星期天（2）共轭效应

产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640

F0.10.290.460.600.52荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。（3）刚性平面结构芴联苯

F=1

F=0.2第34页,共105页，2024年2月25日，星期天不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光

F=0.92萘VA

F(萘)=5

F(VA)

荧光黄酚酞偶氮菲偶氮苯第35页,共105页，2024年2月25日，星期天ａ．给电子取代基加强荧光（4）取代基效应—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生

p→π共轭化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10

18

20

20

20ｂ．得电子取代基减弱荧光、加强磷光二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1→T1的系间窜跃产率接近1—C=0，—COOH，—NO2不产生p→π共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光第36页,共105页，2024年2月25日，星期天ｃ．取代基的位置空间位阻对荧光发射的影响

F=0.75

F=0.03反式二苯乙烯强荧光物质立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质OH-H+电离效应对荧光发射的影响pH=1,有荧光pH=13,无荧光第37页,共105页，2024年2月25日，星期天空间位阻对荧光发射的影响ｃ．取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质

F=0.75

F=0.03立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质电离效应对荧光发射的影响OH-H+OH-H+pH=1,有荧光pH=13,无荧光无荧光有荧光第38页,共105页，2024年2月25日，星期天含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。（5）重原子取代基效应—Cl，—Br，—IS1→T1的系间窜跃由于重原子的存在增强化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax(nm)470476473483484488

P/

F0.0930.0530.0685.26.4>1000τF

(s)2.62.51.40.230.0140.0023（6）溶剂效应蓝移:△

En→π*

＜△

En→π*

红移:

△

Eπ→π*

＞△

Eπ→π*

在极性溶剂中：无溶剂化作用有溶剂化作用第39页,共105页，2024年2月25日，星期天３．金属螯合物的荧光（1）螯合物中配位体的发光（2）螯合物中金属离子的发光8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光2,2`-二羟基偶氮苯无荧光2,2`-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光T1系间窜跃S0S1d*、f*d*→

df*→

f荧光分子内能量转移第40页,共105页，2024年2月25日，星期天４．荧光的熄灭（1）碰撞熄灭荧光熄灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。相对速率

1K1[M*]K2[M*][Q]与分子的直径、粘度、温度等因素有关。（2）能量转移熄灭再吸收过程：共振能量转移：分子内能量转移：hv激发发射熄灭第41页,共105页，2024年2月25日，星期天（3）氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂（4）自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)自吸收：没有除氧，溶液中难以观察到磷光由于

F<1，使荧光强度减弱或消失.形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。第42页,共105页，2024年2月25日，星期天6.３荧光(磷光)分光光度计１．主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器比较荧光分光光度计与紫外－可见分光光度计的异同点。第43页,共105页，2024年2月25日，星期天２．光源（1）光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命（2）氙灯光源常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h最广泛应用的连续光源：

发射波长范围宽发射光强度大第44页,共105页，2024年2月25日，星期天（3）高压汞灯光源应用广泛的线光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm)光源样品池激发滤光片检测器数据处理仪器控制发射滤光片第45页,共105页，2024年2月25日，星期天461激发光源荧光测量中所用激发光源一般比吸收测量中的光源强度大，通常采用汞弧灯、氢灯或氙灯．

2滤光器和单色器在荧光计中使用滤光片．大多数荧光分光光度计都采用光栅单色器．一般带有两个单色器，一是激发单色器，其作用是获得单色性好的激发光，以激发样品产生荧光；一是发射单色器，其作用在于分出某一波长的荧光，以减少干扰．第46页,共105页，2024年2月25日，星期天47

3检测器荧光的强度很弱，因此要求检测器有较高的灵敏度．一般用光电管或光电倍增管作光电元件。

4试样液池荧光测量用的液池通常用石英制成，形状以正方形或长方形为宜，也有用圆形的。第47页,共105页，2024年2月25日，星期天48荧光强度与透过光强度相比小得多，因此在测量荧光时必须严格消除透过光的影响。在测量荧光的仪器中，是在与入射光和透过光相垂直的方向上来测量荧光。利用这类仪器可方便地获得荧光激发光谱和荧光发射光谱。荧光激发光谱主要用于选择激发光波长。第48页,共105页，2024年2月25日，星期天３．单色器平面衍射光栅线色散率聚光本领分辨率４.检测器光电倍增管放大倍数：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109５.样品池：液池、荧光池ａ.

样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样ｂ.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光

荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围ｃ.使用注意事项容易破碎沾污问题闪跃特性比较：荧光分光光度计的样品池与紫外－可见分光光度计的吸收池有什么区别。第49页,共105页，2024年2月25日，星期天50荧光定性和定量分析1．荧光分析法的特点（1）灵敏度高与紫外-可见分光光度法比较，荧光是从入射光的直角方向检测，即在黑背景下检测荧光的发射。（2）选择性强荧光法既能依据特征发射，又能依据特征吸收来鉴定物质。（3）试样量少和方法简便。第50页,共105页，2024年2月25日，星期天51（4）提供比较多的物理参数．

荧光分析法的缺点是它的应用范围还不够广泛．另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素敏感，干扰因素也较多．目前荧光分析大多用于定量测定．第51页,共105页，2024年2月25日，星期天52应用荧光光谱法主要应用于元素的荧光测定。以形成荧光配合物进行荧光分析的元素目前已达60余种，其中铍、铝、硼、镓、硒、镁以及某些稀土元素常用荧光法进行测定．可采用荧光猝灭法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍等。第52页,共105页，2024年2月25日，星期天玻璃滤光片的透射率干涉滤光片的透射率截止涉滤光片的透射率第53页,共105页，2024年2月25日，星期天360nm2.25mm玻璃的透射性质第54页,共105页，2024年2月25日，星期天石英的透射性质200nm2.5mm第55页,共105页，2024年2月25日，星期天６.磷光分光光度计（1）光学系统与荧光分光光度计的区别：切光器光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器切光器（斩波器）共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：10~10-4sec迟滞荧光：100~10-4sec（2）样品池与荧光分光光度计的区别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。磷光镜遮断激发光

--测磷光磷光镜不遮断激发光

--磷光+荧光第56页,共105页，2024年2月25日，星期天紫外-可见分光光度计主要组成及部件的功能光源碘钨灯氘灯单色器测量池参比池样品池光电倍增管数据处理和仪器控制光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制第57页,共105页，2024年2月25日，星期天

荧光(磷光)分光光度计

主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器比较荧光分光光度计与紫外－可见分光光度计的异同点。第58页,共105页，2024年2月25日，星期天紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器磷光分光光度计：切光器第59页,共105页，2024年2月25日，星期天磷光分光光度计：切光器光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器切光器（斩波器）磷光镜遮断激发光：测磷光磷光镜不遮断激发光：磷光+荧光第60页,共105页，2024年2月25日，星期天可拆卸圆形测量池两面透光圆形测量池两面透光1cm长方形测量池两面透光气体测量池两面透光微量测量池两面透光流动测量池两面透光紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)第61页,共105页，2024年2月25日，星期天紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p第62页,共105页，2024年2月25日，星期天6.４荧光分析法的应用１.工作曲线法荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高103～104荧光熄灭工作曲线法FxFCsCx直接荧光标准曲线法FCsFxCx２.荧光分析法的灵敏度Ａ∝εＩＦ∝Ｋ，φＦ，Ｉ０，ε第63页,共105页，2024年2月25日，星期天在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。３.荧光分析的应用（1）无机化合物＊直接荧光测定法其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10mg/L某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W＊荧光熄灭测定法自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。第64页,共105页，2024年2月25日，星期天＊催化荧光测定法较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。＊低温荧光测定法常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮－1960C较常测定的元素有：Ce、Sm、Tb等稀土元素

Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn＊固体荧光测定法固体荧光法在荧光分析中也经常用到第65页,共105页，2024年2月25日，星期天芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。（２）有机化合物待测物试剂λexmaxλemmax测定范围ppm丙三醇苯胺紫外蓝色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50维生素A无水乙醇3454900~20蛋白质曙红丫紫外5400.06~6肾上腺素乙二胺4205250.001~0.02

青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺邻苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-4（3）生命与生物物质第66页,共105页，2024年2月25日，星期天676.５化学发光分析法

化学发光是由化学反应激发物质所产生的光辐射。基于化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法，这种分析方法具有灵敏度高、测定线性范围宽、仪器设备简单、分析速度快且易实现自动化等优点。尤其是方法的灵敏度为一般的仪器分析方法所无法比拟。第67页,共105页，2024年2月25日，星期天68１．化学发光反应的条件

化学发光与磷光、荧光的根本区别在于分子受激发时所需能量的来源不同。化学发光是在一些特殊的化学反应体系中，有关分子吸收反应所释放的化学能而处于电子激发态，当电子回到基态时产生的一种电磁辐射。第68页,共105页，2024年2月25日，星期天69任何一个化学发光反应都包括两个步骤，即化学激发和发光，如下式所示：

A+BC*+D（激发）

C*C+hv

（发光）间接的化学发光则按如下反应发生：

A+B+CAB+C*（激发）

C*C+hv

（发光）这种由于加入发光能量接受体C所导致的化学发光称为敏化化学发光或活化化学发光．第69页,共105页，2024年2月25日，星期天70化学发光反应可以在气相、液相或固相进行，分别称为气相化学发光、液相化学发光或固相化学发光。若化学发光在两个不同相间进行（如气体通过固体表面或液-固界面上进行的发光反应）就称为异相化学发光。其中，液相化学发光的应用范围最广。第70页,共105页，2024年2月25日，星期天71化学发光反应都包括化学激发和发光两个步骤，则有

ψCL=ψCE·ψEN(1)式中ψCL为化学发光效率；ψCE为生成激发态分子效率；ψEN为激发态发光效率，ψCL、ψCE分别定义为：第71页,共105页，2024年2月25日，星期天72则化学发光的效率为：第72页,共105页，2024年2月25日，星期天73一个化学反应要成为化学发光反应必须满足下面几个要求：（１）化学反应要提供足够的能量生成激发态，也就是要有足够的激发能

E＊．激发能的主要来源是反应焓

Hr．大多数的化学发光反应实例中，观察到的光子能量均比

Hr大．在

Hr＜

Ｅ＊的条件下，将要由反应的活化焓

H*提供这种附加的能量．因此，必须有：

Hr＋

H*≥

Ｅ＊

第73页,共105页，2024年2月25日，星期天74满足上式只是满足产生化学发光的必要条件而不是充分条件，有机发色基激发态的能量

E＊通常在150~400kJ·mol-1（对应于570~280nm）范围。（２）至少要有一种物质能够接受化学反应的能量生成激发态。（３）在反应条件下激发态分子能够以光辐射的形式释放能量回到基态。第74页,共105页，2024年2月25日，星期天75２．化学发光分析的基本原理化学发光分为快发光和慢发光．化学发光的反应过程可用发光强度与时间的关系曲线来描述。图中t1为化学发光峰值出现的时间，t2为化学发光峰值衰减了90%时的时间。对于快发光，t1≤1s，化学发光衰减时间即t2－t1≤5s；对于慢发光来说t2－t1>5s。还有一种慢发光，化学发光强度在一段时间基本保持不变，然后再较快的上升或下降。第75页,共105页，2024年2月25日，星期天76化学发光的动力学曲线第76页,共105页，2024年2月25日，星期天77设某分析物与过量试剂作用而发光，则此时的化学发光强度与分析物浓度有如下关系式中，ICL(t)为在时刻t的化学发光强度，以每秒产生的光量子数表示，

ＣＬ为化学发光效率，-dc/dt为分析物参加反应的速度，即每秒参加反应的分子数。(2)第77页,共105页，2024年2月25日，星期天78为了提高测量的灵敏度，也可采用测量峰面积，即在一定时间间隔内对化学发光强度进行积分，得到发光强度的积分值：(3)第78页,共105页，2024年2月25日，星期天79此时，t1和t2若为反应过程中的某一段时间间隔，则积分值只是部分化学发光强度的积分值。如果t1取零，t2取反应结束所需时间，得到的就是整个反应产生的总发光强度。它相当于化学发光动力学曲线下的整个峰面积，它与分析物浓度存在线性关系。这种分析方法实质上是一种平衡法，特别适于慢的化学发光。第79页,共105页，2024年2月25日，星期天80当然，化学发光反应对指定的测定最好是专属的（如酶法化学发光），这样就勿需实行光学分辨或化学方法排除干扰．许多化学发光的强度与分析物质的浓度在几个数量级之内呈良好的线性关系．第80页,共105页，2024年2月25日，星期天81３．化学发光反应的类型（1）直接化学发光和间接化学发光直接化学发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。表示如下：

A+B

C*+DC*

C+hv式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*。当C*跃回激态时，辐射出光子。第81页,共105页，2024年2月25日，星期天82间接化学发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始激发态C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃回基态时，产生发光．如下式表示：

A+B

C*+D

C*+F

F*+E

F*

F+hv式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。例如，用罗丹明B－没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3，其化学发光反应就属这一类型。第82页,共105页，2024年2月25日，星期天83没食子酸+O3

A*+O2

A*+罗丹明B罗丹明B*+B罗丹明B*罗丹明B+hv没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射光子，该光辐射的最大发射波长为584nm。第83页,共105页，2024年2月25日，星期天84气相化学发光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。NO与O3的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为

NO+O3

NO2*+O2

NO2*

NO2+hv（2）气相化学发光和液相化学发光第84页,共105页，2024年2月25日，星期天85这个反应的发射光谱范围为666~875nm，灵敏度可达1ng/ml。也可同时测定大气中NO2的含量，将NO2还原为NO，测定二者的总量，再减去NO的量。液相化学发光的几种体系：鲁米诺、光泽精、过氧化草酸酯第85页,共105页，2024年2月25日，星期天86（3）异相化学发光和生物化学发光异相化学发光如在含有罗丹明B和没食子酸的硅胶上，O3与没食子酸反应生成高能中间体A*，然后将能量转移给罗丹明B接受体而发光。该反应用于气球探测器或气相卫星上，以便测定大气或同温层的O3含量。第86页,共105页，2024年2月25日，星期天87生物化学发光

荧火虫素与三磷酸腺苷（ATP）反应，在萤火虫素酶（E）与Mg2+存在时生成萤火虫素与一磷酸腺苷（AMP）的复合物和焦磷酸镁，然后复合物与氧发生化学发光反应，φCL接近于1。该体系可测定2×10-17mol·L-1的ATP，这相当于一个细菌的ATP含量，灵敏度很高，选择性很好。第87页,共105页，2024年2月25日，星期天88４．鲁米诺化学发光反应的机理在常用的化学发光分析的发光物质中，鲁米诺的应用最广泛。深入的研究已经给出鲁米诺化学发光反应机理的初步模式。它产生化学发光反应的ψCE为0.01~0.05。第88页,共105页，2024年2月25日，星期天鲁米诺氧化发光原理hv(λmax=425nm）3-氨基苯二甲酰环肼第89页,共105页，2024年2月25日，星期天90鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中可被一些氧化剂氧化，产生最大发射波长为425nm的化学发光。发光过程有两种方式，即单电子氧化和双电子氧化，单电子氧化得到中间体鲁米诺游离基；双电子氧化得到中间体叠氮醌，而最后发光体是3-氨基邻苯二甲酸根阴离子。在碱性溶液中，I2与鲁米诺的化学发光反应属于双电子氧化过程，该化学发光体系可检测碘的浓度低达5

10-10mol·L-1。第90页,共105页，2024年2月25日，星期天91金属离子催化鲁米诺-H2O2体系的化学发光反应大都属于单电子氧化过程。例如：

Mn++HO2-→Mn+·HO2-Mn+·HO2-+鲁米诺＋H2O→M(n+1)++鲁米诺游离基＋3OH-

鲁米诺游离基+HO2-→化学发光上述历程中Mn+（如Co2+）参与了反应，价态升高，本身是还原剂。第91页,共105页，2024年2月25日，星期天92４．液相化学发光的测量仪器大多数化学发光和生物发光测量仪器称为光度计，因为这类仪器只有光电检测，没有单色器提供光色散。也有人称这类仪器为发光光度计。商品名称则更为多种多样。液相化学发光的一个重要优点是仪器比较简单，一般仅有进样系统和检测系统组成。第92页,共105页，