基因与基因工程

基因工程的创立与发展与基因的研究之间的内在联系

基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果；

基因工程技术的发展与应用，又深刻并有力地影响着基因的研究，使我们对基因本质的认识提高到了一个空前的高度。第2页,共64页，2024年2月25日，星期天1基因研究的发展基因的发展大体可划分为三个阶段基因的染色体遗传学阶段(细胞遗传学):

20世纪50年代之前，主要从细胞染色体水平上进行研究。基因的分子生物学阶段(分子遗传学):

20世纪50年代之后，主要从DNA水平上进行研究。基因工程学阶段(分子生物技术):

20世纪70年代，重组DNA技术的建立，使基因的研究进入了反向生物学研究阶段。第3页,共64页，2024年2月25日，星期天5´3´5´5´3´3´2DNA的分子结构及其特点DNA分子中各脱氧核苷酸之间以3´-5´磷酸二酯键连接。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息。5´3´DNA分子是脱氧核苷酸的多聚体。第4页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA碱基组成特点和规律不同物种间DNA碱基组成一般是不同的；一个给定物种的DNA碱基组成不因个体的年龄、营养状态和环境改变而改变

；

DNA碱基组成的Chargaff定律：腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即[A]=[T]；鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数也相等，即[G]=[C]；嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即[A]+[G]=[C]+[T]。第5页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA的双螺旋结构（Watson-Crick模型）5´3´5´3´5´3´5´3´磷酸脱氧核糖碱基T-A碱基对C-G碱基对小沟大沟第6页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA复制的一般特点

1、半保留复制2、固定的起点和方向3、半不连续4、需要RNA作为引物5、需要模板

DNA的特性DNA的复制

第7页,共64页，2024年2月25日，星期天DNA

的半保留复制实验依据

1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.[15N]DNA原始分子[14N-15N]DNA第一子代[14N]DNA[14N-15N]DNA第二子代第8页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA的特性DNA的变性

是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等），称为DNA变性。

第9页,共64页，2024年2月25日，星期天

增色效应（hyperchromiceffect）由于DNA在260nm处有最大吸收值，因此，可利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程。在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应。第10页,共64页，2024年2月25日，星期天

熔解温度（meltingtemperature,Tm）通常把DNA分子双螺旋结构失去一半时的温度称为熔点或熔解温度（meltingtemperature,Tm）。DNA的Tm一般在70-85℃之间。第11页,共64页，2024年2月25日，星期天1）DNA的均一性：均一性高的DNA，Tm值的范围越窄；DNA的Tm值与以下因素有关：2）溶剂的性质：离子强度较低的介质中，DNA的Tm值较低，熔解温度的范围也较窄。因此，DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1MNaCl溶液中较稳定；

3）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越高。第12页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA的特性DNA的复性与杂交

复性(renaturation)：变性DNA在适当条件，二条彼此分开的互补链重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性或退火(annealing)。杂交(hybridization):当DNA复性时，来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子

。第13页,共64页，2024年2月25日，星期天复性在基因工程中的应用显示不同生物体间的遗传相关性；检测特定的DNA；考查某些序列在特定生物体DNA中的拷贝数；确定特定碱基序列在DNA中的位置；分离克隆基因。第14页,共64页，2024年2月25日，星期天第15页,共64页，2024年2月25日，星期天第16页,共64页，2024年2月25日，星期天12345CKSouthernbloting第17页,共64页，2024年2月25日，星期天3基因的定义

经典的基因概念：在染色体或DNA分子上，基因是成串珠似的一个挨一个地排列着，它们之间是由非遗传的物质连接起来。交换只是在基因之间进行，而不是在基因内部发生。基因的三位一体论

遗传功能单位交换单位突变单位第18页,共64页，2024年2月25日，星期天顺反子概念的提出

1955年，Benzer通过对噬菌体的研究提出了顺反子(cistron)概念。顺反子(cistron)

：编码一种完整多肽链的核苷酸序列。这种多肽既可以是一种具有生物活性的蛋白质，也可同别的多肽聚合形成多功能的蛋白质。

第19页,共64页，2024年2月25日，星期天顺反子是功能单位，其最小交换单位(又称交换子)和最小突变单位(又称突变子)，都应是DNA分子中的一个核苷酸对。顺反子概念表明，基因不是最小的单位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区。

第20页,共64页，2024年2月25日，星期天基因就是合成有功能意义的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。基因的分子定义：按照这个定义，一个基因应包括哪些部分？

？第21页,共64页，2024年2月25日，星期天4基因的结构1．基因的组成部分基因编码区(codingregion)非编码区(nocodingregion)启动区(promoterregion)

终止区(terminatorregion)第22页,共64页，2024年2月25日，星期天编码区(codingregion)含有大量的遗传密码，包括起始密码子(AUG)和终止密码子(UAA,UAG或UGA)，以及表达子(exon)。

非编码区(nocodingregion)指基因分子结构中存在的对于遗传信息表达所必须的、但却不能转译成蛋白质多肽的DNA序列。

5

-UTR，即5

-末端非转译区；3

-UTR，即3

-末端非转译区；Intron，即真核基因的间隔子序列。第23页,共64页，2024年2月25日，星期天启动区(promoterregion)指位于基因5

上游的一段具有特殊功能的DNA序列区，RNA聚合酶是通过同它结合作用而启动基因的转录。终止区(terminator)位于基因3

端下游外侧与终止密码子相连的一段非编码的核苷酸短序列区，具有终止转录信号的功能。第24页,共64页，2024年2月25日，星期天按照基因的定义，一个基因应包括：⑴编码蛋白质多肽链或RNA的核酸序列；⑵保证转录所必需的调控序列、5´端非翻译序列、内含子、3´端非翻译序列等所有的核酸序列。第25页,共64页，2024年2月25日，星期天2．原核基因的结构原核基因的范围原核基因(Prokargoticgene)：系指由原核生物如大肠杆菌基因组的编码基因，以及高等植物叶绿体基因组的编码基因，还有线粒体基因组的编码基因，都是属于原核基因。第26页,共64页，2024年2月25日，星期天

……TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAA反向回文序列反向回文序列终止区序列+1-10-35转录区终止区启动区5

上游3

下游原核基因的结构T80A95t45A60A50T96T82T84G78A65C54a45

ATGttgaca…………tataat…TAA5‘UTR3‘UTRN5-9N17NNNNNNNNNNNN……………第27页,共64页，2024年2月25日，星期天原核基因的mRNA结构原核基因的mRNA编码区(是连续不间断的序列)转录而不转译的5

-UTR转录而不转译的3

-UTR第28页,共64页，2024年2月25日，星期天真核基因的范围3．真核基因的结构真核基因(Eukaryoticgene)：系指由真核细胞基因组的编码基因和感染真核细胞的DNA病毒及反转录病毒基因组的编码基因均属于真核基因。第29页,共64页，2024年2月25日，星期天+1-20-70转录区终止区启动区-80TATACCAATGC增强子内含子剪接点内含子剪接点内含子真核基因的结构加尾信号…ggccacaccc…ggccaatct…ggggcatataa………ATGCAACGGGCT…TGTGCTAT5‘UTR…GTCACTCAGgtaagg……catataggccaa……ctgcagTAGCAGCTG……AATAAA3‘UTR第30页,共64页，2024年2月25日，星期天真核基因的mRNA结构真核基因的mRNA5

端帽的结构5

-UTR3

端poly(A)尾巴编码区3

-UTRm7G5’ppp-NmpNp-…AUGCTT…CAACGGUAA…AAUAAA……AAAAAA…5

端帽的结构

3

端poly(A)尾巴第31页,共64页，2024年2月25日，星期天5基因的类型1．根据产物类型分类结构基因(Structuralgenes)除了调节基因以外的编码任何RNA或蛋白质产物的基因。

调节基因(Regulatorgenes)其产物能够控制另外一个基因或若干基因表达效率的基因。例如大肠杆菌lac操纵子的laci基因，其编码蛋白质能够控制lac操纵子结构基因的表达。第32页,共64页，2024年2月25日，星期天无诱导物时葡萄糖(+),乳糖(–)结构基因表达关闭第33页,共64页，2024年2月25日，星期天2．根据表达特性组成基因(Constitutivegenes)又叫做看家基因(Housekeepinggene)，是一类理论上在所有细胞类型中都能进行表达、并为所有类型细胞生存提供必需的基本功能的基因。诱导基因(Induciblegenes)因环境中某种特殊物质的存在而被诱导表达的基因，叫做“诱导型基因”，简称“诱导基因”。第34页,共64页，2024年2月25日，星期天3．根据实验用途选择基因(Selectablegenes)

是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的新的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择性培养基，将转化的新细胞从其亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。

选择基因主要是一类编码可使抗菌素(诸如氨苄青霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素等)或除草剂失活的蛋白酶基因。第35页,共64页，2024年2月25日，星期天

Amp选择培养基筛选A.pBridge-GmMYBZ1B.pBridge-GmMYBZ2C.pBridge-GmMYBJ6D.pBridge-GmMYBJ7

D

A

B

C

第36页,共64页，2024年2月25日，星期天C

A

B

D

A.CKB.GmMYBZ2C.GmMYBJ6D.GmMYBJ7第37页,共64页，2024年2月25日，星期天报告基因(reportergene)特指其编码产物能被快速检测，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞、器官或组织的一类特殊的基因。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，

-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，以及绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因。第38页,共64页，2024年2月25日，星期天promoter-GUSexpressionpattern第39页,共64页，2024年2月25日，星期天subcellularlocalizationoftheOsAbc1-2protein第40页,共64页，2024年2月25日，星期天3．根据结构特点断裂基因(splitgene)编码序列不连续的间断基因，即在其核苷酸序列中间插入了与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成若干个不连续的区段。第41页,共64页，2024年2月25日，星期天splitgene第42页,共64页，2024年2月25日，星期天移动基因(movablegene)又叫跳跃基因或转位因子，是指一种可以在染色体基因组上移动，甚至在不同染色体之间、噬菌体及质粒DNA之间跃迁的DNA短片段。

1951年由BarbaraMclintock（麦克林托克）首次在玉米中发现了一种控制元件，后来这个元件被命名为转座元件或转座子。由此，BarbaraMclintock在1983年获得了诺贝尔奖。第43页,共64页，2024年2月25日，星期天特点：不必借助同源序列就可移动的DNA片段，即转座作用与供体和受体之间的序列无关。转座序列可沿染色体移动，也可在不同染色体间跳跃（又称之为跳跃基因）。原核生物和真核生物均有转座子。第44页,共64页，2024年2月25日，星期天

玉米转座因子对胚乳颜色的影响紫色无色紫色斑点？第45页,共64页，2024年2月25日，星期天假基因(pseudogene)指一类同野生型基因序列大部分同源，但由于突变而失去活性的畸变的核苷酸序列。重叠基因(overlappinggene)又叫嵌套基因(nestedgene)。系指核苷酸编码序列彼此重叠的、编码不同蛋白质的两个或多个基因。重复基因(repeatgene)以串联方式重复排列在特定染色体上的某些多拷贝基因。如rRNA基因、tRNA基因等。第46页,共64页，2024年2月25日，星期天6基因的表达1．正义链与反义链早期文献：正义链(有意义链)：双链DNA分子中转录成RNA分子的模板链。反义链(无意义链)：与有意义链互补的DNA链。第47页,共64页，2024年2月25日，星期天现代文献：反义链(-链)：双链DNA分子中转录成RNA分子的模板链。正义链(+链)：双链DNA分子中的编码链。除了以T碱基取代U碱基之外，与RNA转录本具有同样的序列结构。第48页,共64页，2024年2月25日，星期天2．基因的表达基因表达：基因通过DNA的转录和RNA的翻译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质多肽链(或RNA转录本)的过程。定义：第49页,共64页，2024年2月25日，星期天组成性表达(constitutiveexpression)基因表达的方式看家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达视为基本的或组成性基因表达。第50页,共64页，2024年2月25日，星期天适应型或调节型表达(adaptiveorregulatoryexpression)

有一些基因表达极易受环境变化影响而改变，称为适应型或调节型表达。在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可诱导的，称为诱导。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，基因表达产物水平降低，称为阻遏。第51页,共64页，2024年2月25日，星期天第52页,共64页，2024年2月25日，星期天时间特异性：按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，这是基因表达的时间特异性。多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性。基因表达的时间性及空间性空间特异性：在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，这就是基因表达的空间特异性，又称细胞特异性或组织特异性。第53页,共64页，2024年2月25日，星期天mRNA加工成熟水平上的调控(differentialprocessingofRNAtranscript)转录水平上的调控(transcriptionalregulation)翻译水平上的调控(differentialtranslationofmRNA)3.基因的表达调控基因表达的调控水平DNA水平上的调控(regulationonDNAlevel)翻译后水平上的调控(differentialpost-translationofmRNA)第54页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNARNA反馈(?)转录复制

翻译

蛋白质生理功能图:遗传信息传递的“中心法则”示意图（21世纪后修正的）tRNA和rRNA小RNA（microRNAs）非编码RNA（Non-codingRNA）第55页,共64页，2024年2月25日，星期天顺式作用元件和反式作用因子顺式作用元件(cis-actingelement):是指影响自身基因表达活性的DNA序列（如转录启动子和增强子）。它作为一种原位（insitu）顺序，其活性只影响与其自身处在同一个DNA分子上的基因。第56页,共64页，2024年2月25日，星期天启动子起正性调控作用

增强子顺式作用元件起负性调控作用——沉默子第57页,共64页，2024年2月25日，星期天反式作用因子(trans-actingfactor)：调控转录的各种蛋白因子总称反式作用因子。其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上。第58页,共64页，